中國(guó)HIV-AIDS患者B7-H1的表達(dá)特點(diǎn)及與疾病進(jìn)展關(guān)系的研究.pdf

1、目的： 艾滋病(Acquired immunodeficiency syndrome，AIDS)是由人類免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus，HIV)引起的免疫缺陷性疾病，Trabattoni等發(fā)現(xiàn)HIV感染者T細(xì)胞、B細(xì)胞、單核細(xì)胞B7-H1表達(dá)與疾病進(jìn)展密切相關(guān)，有效HAART治療顯著降低病毒血癥患者B7-H1的表達(dá)水平，還有研究顯示，B7-H1/PD-1可抑制HIV病毒特異性T細(xì)胞增殖和細(xì)

2、胞因子分泌。中國(guó)人群的遺傳背景不同于國(guó)外人群，B7-H1表達(dá)水平與HIV感染疾病進(jìn)展的相關(guān)性研究國(guó)內(nèi)外少見報(bào)道，尚無對(duì)于同一患者B7-H1及其配體同時(shí)檢測(cè)的研究，探討B(tài)7-H1/PD-1抑制途徑與效應(yīng)T細(xì)胞功能降低之間的的關(guān)系，將為闡明HIV感染效應(yīng)T細(xì)胞免疫耐受的可能機(jī)制及臨床免疫治療提供新的思路。 材料和方法： 1、研究對(duì)象： 36例未經(jīng)抗病毒治療的HIV/AIDS患者均來自中國(guó)遼寧，其中男性22例，女性14

3、例，年齡分布為19-58歲(39.17±10.64)，所有患者均經(jīng)Genelab公司蛋白印跡試劑盒確認(rèn)為HIV抗體陽性。根據(jù)HIV感染時(shí)間和CD4+T細(xì)胞數(shù)量將上述患者分為HIV組(CD4+T細(xì)胞≥200個(gè)/μl，無艾滋病指征性疾病)和AIDS組(CD4+T細(xì)胞<200個(gè)/μl或出現(xiàn)艾滋病指征性疾病)。36例HIV/AIDS患者中HIV組21例、AIDS組15例。健康對(duì)照組為20例隨機(jī)抽取的HIV抗體陰性、未暴露于HIV的健康人，性別、

4、年齡均與HIV/AIDS患者匹配，平均年齡為27-52歲(38.1±7.61)，其中男性11名，女性9名。所有研究對(duì)象無菌采靜脈血5ml(EDTA抗凝)，并在抽血留樣前均簽署知情同意書并進(jìn)行了相關(guān)問卷調(diào)查。 2、標(biāo)本采集： 用EDTA抗凝負(fù)壓真空采血管采集研究對(duì)象外周靜脈血5ml，在6小時(shí)內(nèi)進(jìn)行試驗(yàn)。 3、CD4+T淋巴細(xì)胞絕對(duì)計(jì)數(shù)T淋巴細(xì)胞絕對(duì)值： 依據(jù)1997年美國(guó)CDC關(guān)于HIV感染者CD4+T細(xì)胞

5、檢測(cè)指導(dǎo)方法，應(yīng)用BD公司TruCOUNT管、FACSCalibur流式細(xì)胞儀MULTISET軟件檢測(cè)。將20μlCD4/CD8/CD3TRITEST試劑加入絕對(duì)計(jì)數(shù)管中，經(jīng)反向加樣法加入50μl抗凝血，室溫避光15min，加入免洗溶血素450μl，室溫避光15min，F(xiàn)ACSMULTISET軟件檢測(cè)并進(jìn)行自動(dòng)分析，計(jì)算CD4+、CD8+、CD3+T淋巴細(xì)胞絕對(duì)值及相應(yīng)比值等。 4、密度梯度離心法分離外周血單個(gè)核細(xì)胞：

6、離心管中加入Ficoll-Hypaque淋巴細(xì)胞分離液14ml，沿管壁緩慢加入用PBS稀釋后的抗凝全血30ml，離心400g，30min。用移液管吸取界面層的PBMC，移入另一離心管中。加入5倍體積的PBS緩沖液，洗細(xì)胞2次。 5、外周血B7-H1/PD-1表達(dá)檢測(cè)： 樹突細(xì)胞表面B7-H1表達(dá)水平流式檢測(cè)：向2支流式管中各加入2×106HIV感染者及健康人PBMC，每管加入下列熒光標(biāo)記的組合單抗：①Lin1-FITC、

7、CD11c-APC、HLA-DR-PerCP、IgG1-PE各20ul，②Lin1-FITC、CD11c-APC、HLA-DR-PerCP、B7-H1-PE各20ul，混勻后4℃避光染色30分鐘，用PBS洗滌后加入含1％多聚甲醛的PBS重懸，F(xiàn)ACSAria流式細(xì)胞儀Diva軟件進(jìn)行分析，計(jì)算mDC表面B7-H1表達(dá)的百分率。mDC的表面特征性標(biāo)志為CD11chighHLA-DR+Lin1-。 T淋巴細(xì)胞B7-H1和PD-1表達(dá)

8、水平檢測(cè)：向3支流式管中各加入1×106HIV感染者及健康人PBMC，每管加入下列熒光標(biāo)記的組合單抗：①CD3-PerCP、CD4-APC-cy7、CD8-FITC、IgG1-PE各10ul，②CD3-PerCP、CD4-APC-cy7、CD8-FITC、B7-H1-PE各10ul③CD3-PerCP、CD4-APC-cy7、CD8-FITC、PD-1-PE各10ul，混勻后4℃避光染色30分鐘，用PBS洗滌后加入含1％多聚甲醛的PBS

9、重懸，F(xiàn)ACSAria流式細(xì)胞儀Diva軟件進(jìn)行分析。 6、病毒載量檢測(cè) 以200μl血漿采用標(biāo)準(zhǔn)版模板制備法提取RNA，采用Roche公司HIV-1Monitor1.5commercialkit在COBASAMPLICOR自動(dòng)載量?jī)x上以RT-PCR方法測(cè)定病毒載量。檢測(cè)范圍為400-750，000copies/ml。HIV-1感染者的病毒載量轉(zhuǎn)化為以10為底的對(duì)數(shù)用于統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。 7、統(tǒng)計(jì)分析 所有資料

10、采用SPSS11.5軟件分析。數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)采用單因素方差分析，并進(jìn)行均數(shù)兩兩比較，使用Pearson進(jìn)行相關(guān)性分析，不符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)采用Mann-WhitneyUtest進(jìn)行比較，使用Spearmanrank進(jìn)行相關(guān)性分析，統(tǒng)計(jì)概率采用雙側(cè)檢驗(yàn)，P<0.05時(shí)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 1、HIV/AIDS患者mDC及不同亞群T細(xì)胞B7-H1的表達(dá)水平通過檢測(cè)外周血中B7-H1表達(dá)發(fā)現(xiàn)，和

11、健康對(duì)照相比，HIV/AIDS患者mDC、CD4+、CD8+T細(xì)胞B7-H1的表達(dá)水平顯著增高(P值均<0.05)。其中mDC、CD4+T細(xì)胞表面B7-H1的表達(dá)在NC、HIV組、AIDS組依次升高，P值均<0.05，HIV組CD8+T細(xì)胞表面B7-H1的表達(dá)顯著高于NC組，P<0.05，AIDS組高于HIV組，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 2、HIV/AIDS患者不同亞群T細(xì)胞PD-1的表達(dá)水平和健康對(duì)照相比，HIV/AIDS患者CD4+

12、、CD8+T細(xì)胞PD-1的表達(dá)水平顯著增高(P值均<0.05)。其中CD8+T細(xì)胞表面PD-1的表達(dá)在NC、HIV組、AIDS組依次升高，P值均<0.05，HIV組CD4+T細(xì)胞表面PD-1的表達(dá)顯著高于NC組(P<0.05)，AIDS組高于HIV組，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。mDC表面不表達(dá)PD-1。 3、B7-H1/PD-1的表達(dá)水平與CD4+T細(xì)胞數(shù)量的相關(guān)性36例HIV/AIDS患者mDC、CD4+T、CD8+T細(xì)胞上B7-H1表

13、達(dá)的百分率與CD4+T細(xì)胞數(shù)量呈顯著負(fù)相關(guān)(mDC+B7-H1+:r=-0.647，P<0.001；CD4+B7-H1+:r=-0.489，P=0.002；CD8+B7-H1+:r=-0.372，P=0.026).CD4+T、CD8+T細(xì)胞上PD-1表達(dá)的百分率與CD4+T細(xì)胞數(shù)量呈顯著負(fù)相關(guān)(CD4+PD-1+:r=-0.374，P=0.025；CD8+PD-1+:r=-0.455，P=0.005)。 4、B7-H1/PD-1

14、的表達(dá)水平與病毒載量的相關(guān)性HIV/AIDS患者mDC、CD4+T、CD8+T細(xì)胞上B7-H1表達(dá)的百分率與病毒載量呈顯著正相關(guān)(mDC+B7-H1+:r=0.662，P<0.001；CD4+B7-H1+:r=0.426，P=0.01；CD8+B7-H1+:r=0.531，P=0.001)。CD4+T、CD8+T細(xì)胞上PD-1表達(dá)的百分率與病毒載量呈顯著正相關(guān)(CD4+PD-1+:r=0.362，P=0.03；CD8+PD-1+:r=0