基于色譜-質(zhì)譜聯(lián)用的知母總皂苷抗阿爾茨海默癥的藥效篩選研究.pdf

1、中藥是中華醫(yī)藥學(xué)的寶貴財(cái)富，對(duì)其進(jìn)行系統(tǒng)的研究對(duì)于繼承和發(fā)展中藥，并得到全世界的認(rèn)同，具有非常顯著的意義。盡管在中國已經(jīng)應(yīng)用了幾千年歷史，但當(dāng)前中藥還難以走向世界，得到國際藥學(xué)同行認(rèn)可，主要原因包括:(1)物質(zhì)基礎(chǔ)不明確;(2)作用機(jī)制不清楚;(3)缺乏有效手段來評(píng)價(jià)中藥療效及傳統(tǒng)中醫(yī)理論的正確性。
　　 知母甾體皂苷具有良好的預(yù)防中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的療效，但是其復(fù)雜的化學(xué)成分和生物利用度，特別是能夠透過血腦屏障的皂苷成分及其代謝

2、產(chǎn)物相關(guān)研究的大大阻礙了其用于大腦神經(jīng)功能紊亂治療藥物的進(jìn)展。本論文綜合了多維色譜質(zhì)譜聯(lián)用，微透析采樣，代謝組學(xué)及模式識(shí)別處理技術(shù)等藥物分析學(xué)科前沿的手段和方法，系統(tǒng)開展了知母總皂苷成分，藥效機(jī)理與阿爾茨海默癥致病機(jī)制的全面研究，并為其它中藥-疾病這種典型的“系統(tǒng)對(duì)系統(tǒng)”的研究模式提供參考。
　　 1.發(fā)展了一種新的全二維液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，以反相色譜(RPLC)用作第一相分離，聚胺色譜(polyamineⅡ)用作第二相分離

3、。該二維色譜不僅簡(jiǎn)化了復(fù)雜的植物樣品制備過程，同時(shí)也擴(kuò)大了峰容量增加了靈敏度，還具有高度的正交性(γ＜0.2）。這些優(yōu)勢(shì)使該方法成功應(yīng)用于復(fù)雜的知母總皂苷體系中共洗脫和微量物質(zhì)的分離。本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用該方法成功的鑒定了31中化合物，包括5種微量化合物和4種甾體類同分異構(gòu)體。該方法可作為復(fù)雜體系不分離分析的研究示范。
　　 2.采用微透析采樣結(jié)合UHPLC/QTOFMS方法檢測(cè)口服知母總皂苷后大鼠血液循環(huán)中未結(jié)合成分，這些成分被認(rèn)為很可

4、能就是知母發(fā)揮藥效的潛在活性成分。通過精確分子量計(jì)算和詳細(xì)的裂解途經(jīng)分析，得到包括七種原型成分和六種代謝產(chǎn)物，其中有三種代謝物之前未見報(bào)道而在本研究中首次得到鑒別。與傳統(tǒng)的生物采樣技術(shù)相比，微透析技術(shù)具有體內(nèi)直接取樣，組織損傷輕，實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)及樣品制備簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)。我們的研究證明，微透析取樣輔助飛行時(shí)間質(zhì)譜能夠有效地在體內(nèi)同時(shí)分析多種有潛在重要生物功能的微量成分。該方法的一些重要的優(yōu)勢(shì)包括分析時(shí)間短，不出現(xiàn)帶同位素標(biāo)記的化合物，使用簡(jiǎn)便。本研

5、究可作為中藥在哺乳動(dòng)物體內(nèi)代謝及藥效物質(zhì)成分篩選重要的研究策略。
　　 3.本研究建立了動(dòng)態(tài)微透析采樣偶聯(lián)UHPLC/QTOFMS的方法和基于代謝組學(xué)數(shù)據(jù)處理技術(shù)，分析檢測(cè)口服知母總皂苷(TSA)的大鼠海馬微透析液，共鑒定得到10種知母皂苷/代謝產(chǎn)物，并采用半定量的方法實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)得到了它們?cè)诤ｑR中濃度的動(dòng)態(tài)變化。通過比較這些皂苷的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)，發(fā)現(xiàn)知母皂苷A-Ⅲ和脫氫薩爾薩皂甙元因具有更快的吸收，較慢的代謝，更高的峰濃度和更大的血藥

6、濃度曲線下面積值，因此可作為藥代標(biāo)示物的候選成分。另外，動(dòng)物行為學(xué)的評(píng)價(jià)結(jié)果也和藥動(dòng)學(xué)數(shù)據(jù)一致，進(jìn)一步證明了上述兩種成分是知母總皂苷(TSA)神經(jīng)保護(hù)作用的生物標(biāo)志物。本研究表明，基于UHPLC/QTOFMS的代謝組學(xué)數(shù)據(jù)處理方法進(jìn)行藥動(dòng)學(xué)篩選不僅可以用于中藥發(fā)揮CNS療效的潛在活性成分研究，也可以幫助我們更好的預(yù)測(cè)天然產(chǎn)物中新的腦靶標(biāo)成分。
　　 4.盡管近年來對(duì)阿爾茨海默癥(AD)的發(fā)病機(jī)理及抗AD藥物的研發(fā)，但是對(duì)于診斷A

7、D及監(jiān)測(cè)藥物的資料療效的生物標(biāo)志物仍然未知。代謝組學(xué)能夠提供一種有效的手段有效地發(fā)現(xiàn)治療和診斷的生物標(biāo)志物，他通過全面系統(tǒng)地分析個(gè)體對(duì)疾病刺激或者藥物干預(yù)后個(gè)體的代謝物相應(yīng)。在本文中，使用了GC-MS、HILIC-MS和RPLC-MS的三種手段聯(lián)合檢測(cè)手段，用來分析AD相關(guān)的代謝物和講清楚知母總皂苷干預(yù)的機(jī)理。通過多元統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，一共有21個(gè)生物標(biāo)志物被篩選出來，其中異-肌醇、尿酸和色氨酸能夠幫助AD組和對(duì)照組進(jìn)行最大的區(qū)分。能量代謝、