人巨細胞病毒通過NF-κB信號途徑誘導人星形膠質細胞表達IL-6和IL-8.pdf

1、目的:
　　 1.觀察人巨細胞病毒(human cytomegalo virus，HCMV)感染對人原代星形膠質細胞IL-6和IL-8的表達變化。
　　 2.探討核因子κB(nuclear factor-kappa B，NF-κB)在HCMV感染致人原代星形膠質細胞分泌改變中的作用。
　　 方法:
　　 1.在人胚肺成纖維細胞中擴增HCMV病毒，并用空斑定量法測定病毒滴度。
　　 2.原代培養(yǎng)人星

2、形膠質細胞，免疫熒光法檢測星形膠質細胞的標志蛋白—膠質纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)，計算細胞純度。
　　 3.HCMV感染人星形膠質細胞，RT-PCR和免疫熒光法檢測HCMV-IE，確定HCMV能否在人原代星形膠質中建立感染。
　　 4.RT-PCR和Western blotting檢測HCMV感染導致星形膠質細胞分泌的IL-6和IL-8表達變化。
　　

3、 5.免疫熒光法檢測NF-κB的細胞核移位，Western blotting檢測阻斷NF-κB細胞核移位后，IL-6和IL-8的表達變化。
　　 結果:
　　 1.HCMV感染人胚肺成纖維細胞5d左右，超過80％細胞出現(xiàn)典型細胞病變效應(CPE)，呈典型的巨細胞病毒感染后的細胞形態(tài)學改變?？瞻邷y定結果顯示將病毒液稀釋10-5倍后，平均空斑數(shù)為5.5，計算后空斑形成單位為1.1×107pfu/ml。
　　 2.分離

4、、純化的原代星形膠質細胞，經(jīng)免疫熒光染色后在倒置顯微鏡下觀察到細胞有較強的特異性綠色熒光，GFAP陽性率達到95％以上。
　　 3.RT-PCR和western blotting結果顯示感染HCMV的星形膠質細胞均可檢測到HCMV-IE的表達，而未感染的細胞則檢測不到。
　　 4.RT-PCR檢測HCMV感染人原代星形膠質細胞0、6、12、24、48和96h時mRNA比值IL-6/β-actin分別為0.23±0.05、

5、1.31±0.07、1.18±0.05、1.13±0.04、0.74±0.02和0.67±0.04，IL-8/β-actin分別為0、0.65±0.04、0.54±0.06、0.42±0.04、0.19±0.03和0.36±0.05。感染組IL-6和IL-8 mRNA的表達較未感染細胞差別具有統(tǒng)計學意義(p＜0.05)。Western blotting檢測感染0、36、48、72、96和120h時蛋白比值IL-6/β-actin分別為0

6、.043±0.01、0.931±0.02、0.852±0.05、0.983±0.03、1.32±0.02和0.95±0.02，IL-8/β-actin分別為0、0.42±0.01、0.61±0.02、1.12±0.03、1.55±0.02和0.81±0.04。感染組IL-6和IL-8蛋白的表達較未感染細胞差別具有統(tǒng)計學意義(p＜0.05）。
　　 5.免疫熒光結果顯示:HCMV感染原代星形膠質細胞2、4、7h時，NF-κB發(fā)生了

7、細胞核移位，其中7h的細胞核移位最為明顯;而用10μM PDTC(NF-κB活化的抑制劑)孵育的細胞用HCMV感染時未見明顯的NF-κB細胞核移位。Western blotting檢測未染毒、PDTC孵育、HCMV感染及HCMV與PDTC共同作用的細胞蛋白比值IL-6/β-actin分別為0.023±0.01、0.017±0.03、1.642±0.01和0.102±0.01，IL-8/β-actin分別為0、0、1.12±0.01和0。