α7 nAChR-NF-κB信號通路在尼古丁影響人牙周膜細胞IL-1β和IL-8表達中的研究.pdf

1、吸煙是牙周炎的重要危險因素，促進牙周炎發(fā)生和發(fā)展，影響牙周炎治療和預后。本課題組前期研究在人和大鼠的牙周組織中發(fā)現(xiàn)煙堿型乙酰膽堿受體α7亞型(alpha7nicotinicacetylcholinereceptor,α7nAChR)的功能性表達，為研究尼古丁在牙周炎發(fā)生發(fā)展中的作用開辟了新視野。核轉(zhuǎn)錄因子κB（Nuclearfactor-kappaB,NF-κB）是免疫和炎癥反應中的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。牙周炎患者牙周組織中NF-κB的表達明顯

2、高于正常人牙周組織。本實驗通過研究尼古丁、α-BTX及PDTC作用于人牙周膜細胞（Humanperiodontalligamentcells,hPDLCs）后NF-κB與α7nAChR的表達，進一步探索尼古丁激活α7nAChR后的信號機制及其在吸煙相關(guān)性牙周炎發(fā)生發(fā)展中的作用。
　　實驗一改良組織塊法培養(yǎng)hPDLCs
　　材料與方法：取11～14歲兒童因正畸需要拔除的第一前磨牙，無菌條件下刮取根中1/3牙周膜組織，改良組織塊

3、法原代培養(yǎng)，常規(guī)傳代，第5代細胞用于后續(xù)實驗。
　　結(jié)果：在3～7d內(nèi)觀察到組織周圍有原代細胞爬出，常規(guī)傳代后，鏡下見細胞密度均勻，鋪滿瓶底，呈放射狀排列，細胞呈長梭形，細胞漿均勻豐滿，核仁圓形且清晰。
　　結(jié)論：采用改良組織塊法成功建立hPDLCs體外實驗模型。
　　實驗二尼古丁和/或α-BTX對hPDLCsNF-κB活性與mRNA表達的影響
　　材料與方法：以體外培養(yǎng)的hPDLCs為實驗模型，通過PCR凝膠電

4、泳實驗檢測α7nAChR激動劑尼古丁以不同濃度和時間作用于hPDLCs后NF-κBmRNA的表達。通過Westernblot檢測α7nAChR激動劑尼古?。?0-5M）和拮抗劑α-BTX（10-8M）作用下hPDLCsNF-κB亞基P65蛋白核內(nèi)含量變化。
　　結(jié)果：不同濃度和時間尼古丁作用于hPDLCs后，各組電泳圖未見明顯差異，灰度分析結(jié)果表明，各組NF-κB的mRNA表達與對照組相比差異無統(tǒng)計學意義。尼古?。?0-5M）作用

5、24h后，hPDLCs細胞核內(nèi)P65蛋白含量明顯增加，并且該作用可以被a-BTX（10-8M）抑制，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。
　　結(jié)論：尼古丁可促進hPDLCsNF-κB亞基P65蛋白的核內(nèi)轉(zhuǎn)移，該作用可以被α7nAChR拮抗劑a-BTX抑制，提示在hPDLCs中尼古丁可能通過α7nAChR調(diào)節(jié)NF-κB活性。本實驗沒有發(fā)現(xiàn)尼古丁影響NF-κBmRNA的表達。
　　實驗三尼古丁和/或α-BTX、PDTC對hPDLC

6、sNF-κB活性和IL-1β、IL-8mRNA表達的影響
　　材料與方法：通過Westernblot檢測α7nAChR激動劑尼古丁（10-5M）和NF-κB抑制劑PDTC（10-5M、3×10-5M、5×10-5M）作用hPDLCs后，NF-κB亞基P65蛋白核內(nèi)含量變化。通過PCR凝膠電泳實驗檢測α7nAChR激動劑尼古?。?0-5M）、拮抗劑α-BTX（10-8M）和NF-κB抑制劑PDTC（5×10-5M）作用hPDLCs后

7、IL-1β和IL-8mRNA表達變化。
　　結(jié)果：尼古?。?0-5M）單獨作用下hPDLCs核內(nèi)P65蛋白含量較對照組升高。濃度梯度PDTC預先孵育30min后，P65蛋白含量隨PDTC濃度增高而下降，PDTC濃度為5×10-5M時P65蛋白含量最低，與尼古丁作用組相比差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。10-5M尼古丁作用下hPDLCsIL-1β和IL-8mRNA表達顯著升高，較對照組差異有統(tǒng)計學意義，a-BTX及PDTC預作用3