白細(xì)胞介素-17(IL-17)正向調(diào)節(jié)星形膠質(zhì)細(xì)胞IL-6正反饋表達(dá)及其調(diào)控機理的研究.pdf

1、研究背景:
　　 星形膠質(zhì)細(xì)胞在神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育、突觸傳遞、神經(jīng)組織修復(fù)與再生、神經(jīng)免疫等方面都起著十分重要的作用。星形膠質(zhì)細(xì)胞是腦內(nèi)特化的免疫細(xì)胞,具有多種免疫功能:(1)分泌眾多產(chǎn)生許多趨化因子和細(xì)胞因子如IL-6、IL-1、IL-3、TNF-α和單核細(xì)胞趨化活化因子等等,從而參與神經(jīng)疾病的免疫防御。(2)星形膠質(zhì)細(xì)胞可增加巨噬細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞吞噬髓磷脂,誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞分化。(3)星形膠質(zhì)細(xì)胞表面的MHC-Ⅱ和B7分子,提呈抗

2、原給CD4+、CD8+T細(xì)胞,促進(jìn)T細(xì)胞增殖?；罨男切文z質(zhì)細(xì)胞表達(dá)具有向特異的T細(xì)胞亞群遞呈脂質(zhì)抗原的能力,從而提示星形膠質(zhì)細(xì)胞可能參與T細(xì)胞非肽抗原的遞呈過程。目前認(rèn)為,星形膠質(zhì)細(xì)胞在免疫系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)之間起到了重要的橋梁作用。
　　 IL-17細(xì)胞因子家族包括6個家族成員--IL-17A(即一般意義上的IL-17)、IL-17B、IL-17C、IL-17D(IL-27)和IL-17E(IL-25)。Th17細(xì)胞通過高表達(dá)I

3、L-17,介導(dǎo)炎性反應(yīng),防御胞外病原菌的感染；Th17細(xì)胞被證實能通過分泌炎癥介質(zhì)IL-17誘導(dǎo)嚴(yán)重的自身免疫反應(yīng),參與自身免疫性疾病和移植排斥等的發(fā)生和發(fā)展；Th17還參與由于腫瘤、外傷和血管性疾病所導(dǎo)致的組織炎癥發(fā)應(yīng),在疾病的不同階段起到重要作用。Th17的分化受細(xì)胞因子水平和轉(zhuǎn)錄水平的多種因素的調(diào)控,其中TGF-β、IL-6、IL-23和IL-1β在促進(jìn)IL-17的分化過程中起到了重要作用。目前已經(jīng)證實在成纖維細(xì)胞中,IL-6不僅

4、可以促進(jìn)Th17的分化,而且IL-17可以誘導(dǎo)靶細(xì)胞表達(dá)IL-6。IL-17通過跨胞膜的IL-17受體A(IL-17RA)和IL-17RC組成的異聚體進(jìn)行信號傳遞,目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了多種類型細(xì)胞可以表達(dá)這兩種IL-17受體。許多證據(jù)表明IL-17RA和IL-17RC異聚體可以激活NF-κB和MAPK信號傳導(dǎo)通路。但是目前關(guān)于IL-17在中樞神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞通路中的研究還很少見。
　　 細(xì)胞因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制因子(suppressor of

5、 cytoldne signaling,SOCS)3是SOCS家族成員之一,其中SOCS3是研究最為廣泛的一種,是JAK/STAT3信號傳導(dǎo)通路的負(fù)向調(diào)節(jié)因子。我們最近發(fā)現(xiàn)TGF-β可以抑制IL-6和IL-21誘導(dǎo)的SOCS3的表達(dá),延長CD4+CD25-T細(xì)胞內(nèi)STAT3通路的活化,從而促進(jìn)Th17的分化,這說明了SOCS3很可能也參與了Th17細(xì)胞的分化調(diào)節(jié)和IL-17的功能。
　　 目前研究的關(guān)鍵在于IL-17在中樞神經(jīng)系

6、統(tǒng)疾病發(fā)生發(fā)展過程中的作用及其調(diào)控機理,確定IL-17在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的主要靶細(xì)胞,將加深我們對IL-17所介導(dǎo)的炎癥發(fā)應(yīng)在神經(jīng)腫瘤、顱腦外傷、腦血管病及自身免疫性疾病作用的認(rèn)識。本課題主要涉及IL-17對星形膠質(zhì)細(xì)胞的作用及其調(diào)控機理,分以下三部分:一、IL-17協(xié)同IL-6/R上調(diào)星形膠質(zhì)細(xì)胞IL-6表達(dá)的研究；二、IL-17正向調(diào)節(jié)星形膠質(zhì)細(xì)胞IL-6正反饋表達(dá)通路作用機理的研究；三、SOCS3負(fù)向調(diào)控星形膠質(zhì)細(xì)胞IL-17和IL-

7、6的協(xié)同作用及其機理的研究。
　　 一、IL-17協(xié)同IL-6/R上調(diào)星形膠質(zhì)細(xì)胞IL-6表達(dá)的研究
　　 目的：
　　 驗證星形膠質(zhì)細(xì)胞IL-17受體的表達(dá),并明確IL-17協(xié)同IL-6/R上調(diào)IL-6的表達(dá)情況
　　 方法
　　 1、RT-PCR檢測星形膠質(zhì)細(xì)胞IL-17RA和IL-17RC的基因表達(dá)情況。
　　 2、RT-PCR和TaqMan Realtime-PCR檢測不同時間點、

8、不同IL-17濃度、不同IL-6R的濃度和IL-17、IL-6及IL-6R不同組合對IL-6基因表達(dá)的影響,并進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析
　　 3、Elisa檢測不同時間點IL-17加IL-6/R對星形膠質(zhì)細(xì)胞IL-6蛋白表達(dá)的影響,并進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。
　　 結(jié)果：
　　 1、星形膠質(zhì)細(xì)胞存在有IL-17RA和IL-17RC的基因表達(dá)。
　　 2、基因和蛋白水平均證實IL-6可以單獨誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞IL-6的表達(dá),I

9、L-17單獨刺激星形膠質(zhì)細(xì)胞不誘導(dǎo)IL-6,但是IL-6/R和IL-17共同刺激星形膠質(zhì)細(xì)胞可以顯著上調(diào)IL-6的表達(dá)。
　　 結(jié)論：
　　 1、星形膠質(zhì)細(xì)胞可以表達(dá)IL-17RA和IL-17RC,為IL-17潛在的靶細(xì)胞。
　　 2、IL-6/R誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞的IL-6表達(dá),驗證了星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)存在IL-6正反饋表達(dá)通路。
　　 3、IL-17協(xié)同IL-6/R可以誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞顯著上調(diào)IL-6的表達(dá)

10、。
　　 二、IL-17正向調(diào)節(jié)星形膠質(zhì)細(xì)胞IL-6正反饋表達(dá)通路調(diào)控機理的研究；
　　 目的：
　　 研究IL-17對于星形膠質(zhì)細(xì)胞IL-6正反饋表達(dá)相關(guān)的信號傳導(dǎo)通路活性的影響,及信號傳導(dǎo)蛋白質(zhì)與DNA在染色質(zhì)環(huán)境下的相互作用,以闡明其上調(diào)IL-6表達(dá)的作用機理
　　 方法
　　 1、應(yīng)用TaqMan Realtime-PCR測定IL-17對IL-6 RNA穩(wěn)定性的影響。
　　 2、應(yīng)

11、用Western Blot測定IL-17對IL-6基因表達(dá)相關(guān)信號傳導(dǎo)通路活性的影響。
　　 3、應(yīng)用NF-κB、ERK MAPK、JNK MAPK和p38 MAPK信號傳導(dǎo)通路的抑制劑檢測各信號傳導(dǎo)通路對IL-6表達(dá)的影響。
　　 4、應(yīng)用染色質(zhì)免疫共沉淀(Chromatin Immunoprecipitation,ChIP)檢測信號傳導(dǎo)通路中的磷酸化蛋白與IL-6啟動序列的結(jié)合情況。
　　 結(jié)果：
　　

12、 1、與IL-6單獨刺激相比,IL-17加IL-6/R能夠上調(diào)星形膠質(zhì)細(xì)胞NF-κB、ERKMAPK、JNK MAPK和p38 MAPK的活性。
　　 2、與IL-6單獨刺激相比,IL-17加IL-6/R對星形膠質(zhì)細(xì)胞IL-6 mRNA穩(wěn)定性的影響沒有顯著性差別。
　　 3、NF-κB傳導(dǎo)通路抑制劑BAY-11、JNK傳導(dǎo)通路抑制劑JNKiII和p38傳導(dǎo)通路抑制劑SB203580可以抑制IL-17加IL-6/R對IL

13、-6基因表達(dá)的協(xié)同作用。
　　 4、IL-17增加IL-6誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞IL-6啟動序列對NF-κB p65、c-Fos、c-Jun、CBP、p300和乙?；慕M蛋白H3和H4的募集。
　　 結(jié)論：
　　 1、IL-17可以協(xié)同IL-6誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)NF-κB、ERK MAPK、JNK MAPK和p38 MAPK的激活。
　　 2、IL-17不影響星形膠質(zhì)細(xì)胞IL-6 mRNA的穩(wěn)定性。
　

14、　 3、IL-17協(xié)同IL-6/R上調(diào)IL-6的基因表達(dá)依賴NF-κB、JNK MAPK和p38MAPK信號傳導(dǎo)通路的激活。
　　 3、IL-17和IL-6/R能誘導(dǎo)上調(diào)NF-κB p65、c-Fos和c-Jun特異性結(jié)合到IL-6自動序列的NF-κB和AP-1綁定位點,且增加IL-6啟動序列對NF-κB p65、c-Fos、c-Jun、CBP、p300和乙酰化的組蛋白H3和H4的募集。
　　 三、SOCS3負(fù)向調(diào)控星

15、形膠質(zhì)細(xì)胞IL-17和IL-6的協(xié)同作用及其機理的研究
　　 目的：
　　 條件性基因敲除SOCS3和應(yīng)用siRNA技術(shù)沉默SOCS3,并檢測基因敲出和基因抑制的效果:檢測SOCS3對IL-17和IL-6/R協(xié)同誘導(dǎo)IL-6基因表達(dá)的調(diào)控作用,并明確其作用機制。
　　 方法
　　 1、RT-PCR和TaqMan Realtime-PCR檢測不同時間點IL-17加IL-6/R對星形膠質(zhì)細(xì)胞SOCS3基因表達(dá)

16、的影響。
　　 2、應(yīng)用siRNA干擾SOCS3的基因表達(dá),并用RT-PCR和TaqManRealtime-PCR驗證基因干擾效果。
　　 3、RT-PCR、TaqMan Realtime-PCR和Elisa檢測siRNA沉默SOCS3對IL-17和IL-6/R協(xié)同誘導(dǎo)IL-6基因表達(dá)的調(diào)控作用。
　　 4、應(yīng)用SOCS3 flox系統(tǒng)體外敲除星形膠質(zhì)細(xì)胞SOCS基因,提取基因組DNA,驗證基因敲除效果。