中期和晚期妊娠胎兒表皮角質(zhì)形成細(xì)胞功能及其微小RNA表達譜的研究.pdf

1、成人皮膚創(chuàng)傷后組織以再生方式愈合，但對于深及真皮的創(chuàng)面而言，機體修復(fù)的結(jié)果往往導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)(Extracellular matrix，ECM)的堆積和瘢痕的形成。這不但影響美觀，更由于瘢痕攣縮影響組織和器官功能[1-5]。相反，哺乳動物胚胎特定時期（早期和中期）的皮膚創(chuàng)傷往往以無瘢痕形式愈合。研究者普遍認(rèn)為，皮膚無瘢痕是胚胎皮膚細(xì)胞本身的生物學(xué)特性決定[6-10]。隨著近年來細(xì)胞生物學(xué)、生物化學(xué)和分子生物學(xué)領(lǐng)域?qū)ζつw創(chuàng)面愈合的研究不斷

2、深入，人們對表皮角質(zhì)形成細(xì)胞(Keratinocytes，KCs)在皮膚炎癥、創(chuàng)面愈合、瘢痕形成和組織重塑方面起了關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用這一觀點已形成共識，皮膚創(chuàng)傷發(fā)生后人表皮KCs與人真皮成纖維細(xì)胞(human dermal fibroblasts，hDFs)共同作用影響著創(chuàng)傷的修復(fù)[11-12]。研究表明，表皮KCs影響hDFs功能是通過一系列細(xì)胞因子來實現(xiàn)。一種方式是表皮來源的細(xì)胞因子或者生長因子直接或間接調(diào)節(jié)膠原合成，另一種是表皮細(xì)胞影

3、響膠原溶解系統(tǒng)，表皮可以合成膠原酶或類似的金屬蛋白酶，或者減少內(nèi)源性蛋白酶抑制劑。無瘢痕愈合中胎兒表皮KCs對于hDFs功能的影響的相關(guān)研究較少。為此，我們研究中期和晚期妊娠胎兒表皮KCs生物學(xué)特性及共培養(yǎng)條件下中期和晚期妊娠胎兒表皮KCs對hDFs功能和多種基因表達的影響。
　　研究者通過基因表達譜芯片技術(shù)已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了中期妊娠和晚期妊娠胎兒皮膚組織中存在大量基因的差異表達，檢測結(jié)果提示皮膚組織基因表達譜和皮膚表型的復(fù)雜調(diào)控模式[1

4、4-16]。微小RNA是存在于動植物中的一類高度保守的非編碼小分子RNA。它們可以特異性的與靶基因mRNA的3'非翻譯區(qū)發(fā)生互補結(jié)合，影響蛋白的翻譯過程或使靶基因mRNA降解，以此對靶基因產(chǎn)生抑制作用。近年來，在皮膚創(chuàng)傷愈合過程中發(fā)現(xiàn)許多微小RNA可能對創(chuàng)傷愈合產(chǎn)生作用，它們的差異表達與皮膚創(chuàng)傷愈合的發(fā)展、預(yù)后等過程有著顯著的相關(guān)性[17]。
　　由于胎兒從無瘢痕愈合到有瘢痕形成過程中表皮生物學(xué)功能的改變與基因表達譜變化相關(guān)，而微

5、小RNA通過與靶基因相互作用影響基因表達。然而，有關(guān)中期和晚期妊娠胎兒表皮KCs微小RNA表達譜尚不明晰。為了揭示微小RNA在中期和晚期妊娠胎兒表皮KCs生物學(xué)行為中的作用機制，我們通過高通量微小RNA表達譜測序技術(shù)進行全景式分析，以其深入探討無瘢痕愈合分子機制，并為臨床瘢痕治療提供可能的分子靶標(biāo)。
　　方法:
　　一、中期和晚期妊娠胎兒表皮KCs生物學(xué)特性的研究
　　1、觀察不同胎齡胎兒表皮組織形態(tài)學(xué)特征。
　

6、　2、原代人中期和晚期妊娠胎兒表皮KCs培養(yǎng)與鑒定。
　　3、利用WST-1細(xì)胞增殖實驗檢測中期和晚期妊娠胎兒表皮KCs增殖能力。
　　4、利用體外劃痕實驗檢測中期和晚期妊娠胎兒表皮KCs遷移活性。
　　5、利用流式細(xì)胞技術(shù)檢測中期和晚期妊娠胎兒表皮KCs表面標(biāo)志物。
　　二、建立共培養(yǎng)體系研究中期和晚期妊娠胎兒表皮KCs對hDFs功能和基因表達的影響
　　1、成年hDFs原代培養(yǎng)與鑒定。
　　2、利

7、用Transwell建立人中期和晚期妊娠胎兒表皮KCs與hDFs共培養(yǎng)體系。
　　3、利用WST-1細(xì)胞增殖實驗檢測中期和晚期妊娠胎兒表皮KCs細(xì)胞對真皮成纖維細(xì)胞增殖活性的影響。
　　4、利用體外劃痕實驗檢測中期和晚期妊娠胎兒表皮KCs對hDFs遷移的影響。
　　5、利用實時定量PCR技術(shù)檢測中期妊娠和晚期妊娠胎兒表皮KCs對hDFs基因表達的影響。
　　6、利用Western Blot檢測中期妊娠和晚期妊娠胎

8、兒表皮KCs對hDFs的基因表達的影響。
　　三、中期和晚期妊娠胎兒表皮KCs微小RNA表達譜的研究
　　1、提取中期妊娠組和晚期妊娠組胎兒表皮KCs的RNA，應(yīng)用微小RNA表達譜（illumina miRNA測序）技術(shù)測序。
　　2、利用實時定量PCR技術(shù)驗證中期和晚期妊娠胎兒表皮KCs的差異表達miRNA。
　　3、生物信息學(xué)分析差異基因表達模式聚類分析，Gene Ontology功能顯著性富集分析，Path

9、way顯著性富集分析。
　　四、miR-203和miR-495與表皮細(xì)胞功能的相關(guān)性研究
　　1、利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將hsa-miR-203和hsa-miR-495模擬物轉(zhuǎn)入人表皮HaCaT細(xì)胞系。
　　3、利用WST-1實驗檢測差異表達的hsa-miR-203和hsa-miR-495對HaCaT細(xì)胞系增殖能力的影響。
　　3、利用體外劃痕實驗檢測差異表達的hsa-miR-203和hsa-miR-495對HaCaT

10、細(xì)胞系遷移能力的影響。
　　結(jié)果:
　　一、中期和晚期妊娠胎兒表皮KCs的生物學(xué)特性
　　1、中期和晚期妊娠胎兒表皮KCs培養(yǎng)與鑒定。
　　2、中期妊娠組胎兒表皮KCs增殖能力顯著升高。
　　3、中期妊娠組胎兒表皮KCs遷移能力顯著升高。
　　4、中期妊娠組胎兒表皮KCs高表達CK14和CK19，不表達CK10，而晚期妊娠組KCs高表達CK14，不表達CK10和CK19。
　　二、中期和晚期妊娠

11、胎兒表皮KCs對hDFs功能和基因表達的影響
　　1、成年hDFs原代培養(yǎng)與鑒定。
　　2、建立人中期和晚期妊娠胎兒表皮KCs與hDFs共培養(yǎng)體系。
　　3、中期妊娠組胎兒表皮KCs共培養(yǎng)明顯促進hDFs增殖。
　　4、中期妊娠組胎兒表皮KCs共培養(yǎng)明顯促進hDFs遷移。
　　5、中期妊娠組和晚期妊娠組胎兒表皮KCs共培養(yǎng)能差異調(diào)節(jié)hDFs多種基因的表達。
　　三、中期和晚期妊娠胎兒表皮KCs微小RN

12、A表達差異及其對應(yīng)的靶基因篩選
　　1、人中期妊娠組胎兒KCs明顯上調(diào)的微小RNA。
　　2、人中期妊娠組胎兒KCs明顯下調(diào)的微小RNA。
　　3、微小RNA-495和微小RNA-203在人中期妊娠組胎兒KCs中表達明顯下調(diào)。
　　四、miR-203和miR-495影響表皮細(xì)胞系HaCaT的增殖和遷移
　　1、構(gòu)建差異表達hsa-miR-203和hsa-miR-495的HaCaT細(xì)胞系。
　　2、體外

13、實驗證明hsa-miR-203和hsa-miR-495抑制表皮細(xì)胞增殖和遷移。
　　五、miR-203和miR-495影響表皮系HaCaT增殖和遷移的機制
　　1、生物信息學(xué)預(yù)測SMAD7、CUL和SMUFR2可能是miR-203影響表皮KCs功能的靶基因。生物信息學(xué)預(yù)測SMAD7、CUL和RBX1可能是miR-495影響表皮KCs功能的靶基因。
　　結(jié)論:
　　1、中期妊娠組與晚期妊娠組胎兒表皮KCs具有不同的

14、生物學(xué)特征。
　　2、中期妊娠組與晚期妊娠組胎兒表皮KCs對真皮成纖維細(xì)胞功能和基因表達的影響不同。不同EGA胎兒表皮細(xì)胞共培養(yǎng)能差異的調(diào)節(jié)成年hDFs MMPs和TIMPs基因表達。妊娠中期組表皮細(xì)胞共培養(yǎng)能明顯促進MMP-1，MMP-2，MMP-3，MMP-9， MMP-14基因表達，明顯降低TIMP-2和TIMP-3基因表達。晚期妊娠組KCs共培養(yǎng)能明顯促進MMP-2，MMP-3，MMP-9，MMP-14基因表達，明顯降低T

15、IMP-1，TIMP-2和TIMP-3基因表達。MMP-3，MMP-9，MMP-14，TIMP-1，TIMP-2，TIMP-3基因表達在中期妊娠中期和晚期組間差異明顯與晚期妊娠組表皮KCs相比，中期妊娠組表皮KCs對hDFs功能和基因表達的影響更有利于無瘢痕愈合。
　　3、中期妊娠組與晚期妊娠組胎兒表皮KCs多種微小RNA差異表達可能是造成胎兒無瘢痕愈合的重要因素之一。
　　4、中期妊娠組多種微小RNA可能通過參與調(diào)控多種m