脲原體拓撲異構(gòu)酶基因突變與喹諾酮類耐藥的相關(guān)性研究.pdf

1、脲原體包括微小脲原體（Ureaplasma parvum,Up）和解脲脲原體(Ureaplasma urealyticum,Uu),是引起人類非淋球菌性生殖道感染的主要支原體類病原體之一。由于脲原體缺乏細胞壁結(jié)構(gòu)，故阻礙細胞壁合成的抗生素如青霉素類、頭孢菌素類等對脲原體感染天然無效。四環(huán)素類、大環(huán)內(nèi)酯類及喹諾酮類抗生素是治療脲原體感染的主要有效藥物。由于抗生素的大量使用及使用不當，脲原體的耐藥現(xiàn)象日趨嚴重，尤其對喹諾酮類氧氟沙星和環(huán)丙沙

2、星的耐藥率分別已高達30％和60％多，久治不愈的病例屢見不鮮，國內(nèi)外對其耐藥機制研究亦逐漸增多.對喹諾酮類耐藥的機制主要與編碼拓撲異構(gòu)酶II（gyrA/gyrB）和拓撲異構(gòu)酶IV(parC/parE)亞單位的基因突變有關(guān)。但目前國內(nèi)外對脲原體的耐藥判斷都缺乏一個標準化的研究方法，這就阻礙了脲原體耐藥株的準確判斷，以及后續(xù)抗生素耐藥情況和基因突變結(jié)果之間的相關(guān)性比較。
　　 本研究在Beeton等研究方法的基礎(chǔ)上進行改良，在96孔

3、板上利用微量肉湯稀釋法對樣本中脲原體菌量和對喹諾酮類藥物的MIC用斷裂點分析法同時進行測定，確定真正的脲原體喹諾酮類耐藥株。收集瑞金醫(yī)院2009.7-12月的門診非淋球菌性尿道炎患者泌尿生殖道標本435例，隨機測定了66份樣本脲原體的精確MIC，同時對脲原體陽性株產(chǎn)物進行基因組提取、PCR擴增喹諾酮類耐藥基因gyrA、gyrB、parC和parE，測序并和NCBI基因庫中標準菌株進行比對，以發(fā)現(xiàn)新的耐藥基因突變位點及本地區(qū)耐藥菌株流行趨

4、勢，以圖進一步闡明脲原體對喹諾酮類耐藥的作用機制。首先，通過改良棋盤稀釋法測定66份樣本的MIC發(fā)現(xiàn)，和臨床上常用的梅里埃的IST2脲原體試劑盒（下面簡稱藥敏卡法）相比，在棋盤稀釋法確定的環(huán)丙沙星、氧氟沙星敏感的解脲脲原體中，藥敏卡法分別將50％（5/10）和48.1％（13/27）的敏感菌株判為中介/耐藥；而在棋盤稀釋法確定的環(huán)丙沙星耐藥的菌株中，藥敏卡法將4.4％（2/45）的菌株判為敏感。另外，通過擴增脲原體陽性株的喹諾酮類耐藥基

5、因gyrA、gyrB、parC和parE,測序并與基因庫中標準株比對發(fā)現(xiàn)：⑴49份耐藥標本中，僅15號一例出現(xiàn)有意義的gyrA突變，即M109K，突變率2.04％（1/49）。⑵26份出現(xiàn)parC突變，突變率53.06％（26/49）。其中23份均出現(xiàn)S83L 的突變，與國內(nèi)外報道一致，突變率為46.94％（23/49）；新發(fā)現(xiàn)了R68P、M89I、A117G突變。⑶有3份發(fā)生了parE突變，突變率6.12％（3/49）。分別是A457

6、T、E467K和R448K、G476R。⑷10份中介標本中有一份發(fā)生了parC的S83L突變，突變率為10％（1/10）。⑸10份中介標本中7份發(fā)生了gyrA基因D112E變異，1份敏感標本也發(fā)生gyrA基因D112E的變異；另外49份耐藥標本中也有38份發(fā)生D112E的變異，這個變異在以前被認為與喹諾酮類耐藥高度相關(guān)，但Beeton認為D112E只是非耐藥相關(guān)的種屬特異的多態(tài)性表現(xiàn)，我們的實驗結(jié)果也證實了這個結(jié)論。⑹60份標本中除了1