課題一 原發(fā)性干燥綜合征患者TCR-ζ鏈的初步研究;課題二 抗α胞襯蛋白抗體在干燥綜合征中的臨床研究.pdf

1、背景：
　　原發(fā)性干燥綜合征(primarySj?grensyndrom,pSS)是一種常見的自身免疫性疾病,患病率大約為0.5％-5%。pSS發(fā)病隱匿,與大多數(shù)自身免疫性疾病類似,患者絕大多數(shù)為女性。pSS病程中可累及多個(gè)臟器,患者的臨床表現(xiàn)常因年齡、性別以及地理環(huán)境的差異性而有所不同。pSS患者可出現(xiàn)口腔、眼部、氣管、皮膚等部位的干燥癥狀,也可有肌肉骨骼(關(guān)節(jié)痛和一過性滑膜炎等),肺部(呼吸困難、肺部炎癥等),腎臟(遠(yuǎn)端腎小管

2、酸中毒等),消化道(吞咽困難、萎縮性胃炎等),肝臟(自身免疫性肝炎等),血管(過敏性血管炎、壞死性血管炎等),神經(jīng)系統(tǒng)(周圍神經(jīng)病變等),淋巴組織(甚至并發(fā)淋巴瘤)等全身多個(gè)組織器官的損傷。pSS的臨床治療主要以對(duì)癥支持治療為主,效果欠佳。pSS的發(fā)病機(jī)制尚不明確,既往的研究通過動(dòng)物模型提供了一些認(rèn)識(shí):1)較強(qiáng)的遺傳因素;2)T細(xì)胞驅(qū)動(dòng)的炎性細(xì)胞浸潤或淋巴細(xì)胞浸潤;3)病毒感染;4)特異性抗體的產(chǎn)生;5)調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的基因影響了慢性淋巴

3、細(xì)胞浸潤。以上原因中,T/B細(xì)胞的異?；罨莗SS特征性的免疫病理改變。尋找T/B細(xì)胞異?；罨年P(guān)鍵點(diǎn)對(duì)于治療及影響pSS疾病轉(zhuǎn)歸具有重要的意義。研究顯示,TCR-ζ鏈(Tcellreceptor-ζchain,CD247)的表達(dá)和功能改變與慢性炎癥和自身免疫性疾病有關(guān),TCR-ζ鏈在T細(xì)胞的活化過程中起到重要作用,那么TCR-ζ鏈的水平高低能否反映pSS疾病的進(jìn)展情況,調(diào)節(jié)TCR-ζ鏈的水平能否延緩甚至逆轉(zhuǎn)pSS的病理過程呢?本研究采

4、用T淋巴細(xì)胞細(xì)胞系和pSS患者外周血作為研究對(duì)象,擬在探討TCR-ζ鏈在T細(xì)胞系中的調(diào)控機(jī)制及其在pSS患者體內(nèi)的表達(dá)水平,并通過與臨床其他檢測(cè)指標(biāo)的聯(lián)合統(tǒng)計(jì)分析,觀察TCR-ζ鏈在pSS疾病發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮的作用。希望通過對(duì)TCR-ζ鏈的初步研究,為進(jìn)一步深入尋找pSS疾病發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵靶點(diǎn)提供一定的理論基礎(chǔ)與科研證據(jù)。
　　目的：
　　1、利用T淋巴細(xì)胞系----Jurkat細(xì)胞,檢測(cè)CD3單克隆抗體刺激前后Jurka

5、t細(xì)胞中TCR-ζ鏈的水平,初步探討其作用機(jī)制;
　　2、檢測(cè)pSS患者組與正常對(duì)照組外周血中TCR-ζ鏈及炎性細(xì)胞因子----白介素33(Interleukin-33,IL-33)的水平,對(duì)比兩組之間的差異,并且分析TCR-ζ鏈與IL-33及其他臨床常用指標(biāo)之間的關(guān)系,尋找其與疾病活動(dòng)度的相關(guān)性,探討TCR-ζ鏈的臨床意義。
　　方法：
　　1、TCR-ζ鏈在T淋巴細(xì)胞系中調(diào)節(jié)機(jī)制的初步研究
　　利用T淋巴細(xì)胞

6、系----Jurkat細(xì)胞系作為刺激實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞模型,通過免疫印跡技術(shù)(WesternBlot,WB)檢測(cè)在CD3單克隆抗體刺激前后,Jurkat細(xì)胞中TCR-ζ鏈的水平。利用灰度檢測(cè)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
　　2、TCR-ζ鏈在pSS患者外周血中水平的檢測(cè)
　　將pSS患者組及正常對(duì)照組的外周血進(jìn)行處理后,行流式細(xì)胞術(shù)(Flowcytometry,FCM),從細(xì)胞水平分析外周血T淋巴細(xì)胞中TCR-ζ鏈(CD3+CD247+細(xì)胞)的

7、含量;利用實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Realtimepolymerasechainreaction,RT-PCR)法,從mRNA水平對(duì)外周血中TCR-ζ鏈進(jìn)行檢測(cè)。最終將結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,相對(duì)表達(dá)量用±SD值表示。
　　3、pSS患者外周血中炎性因子IL-33水平的檢測(cè)以及TCR-ζ鏈與臨床指標(biāo)的相關(guān)性研究
　　收集pSS患者組及正常對(duì)照組外周血,通過酶聯(lián)免疫吸附法(Enzymelinkedimmunosorbentassa

8、y,ELISA)法測(cè)定兩組血清中IL-33的表達(dá)水平,并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。將TCR-ζ鏈、血清IL-33檢測(cè)結(jié)果、pSS患者臨床常用檢測(cè)指標(biāo)(包括血沉、血清免疫球蛋白、血清補(bǔ)體)進(jìn)行分組對(duì)比分析或相關(guān)性統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。借此觀察TCR-ζ鏈與臨床指標(biāo)之間的相關(guān)性,進(jìn)一步探索TCR-ζ鏈的臨床意義。
　　結(jié)果：
　　1、將WB檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行灰度檢測(cè),同一時(shí)間點(diǎn)CD3單克隆抗體刺激組較非刺激組TCR-ζ鏈含量降低,其中24h時(shí)間點(diǎn)兩組之間

9、的差異較12h時(shí)間點(diǎn)兩組之間的差異更大,具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。表明在CD3單克隆抗體的刺激下,隨著時(shí)間的增長Jurkat細(xì)胞中TCR-ζ鏈水平逐漸降低,提示TCR-ζ鏈在T細(xì)胞異常激活中可能起到調(diào)節(jié)作用。
　　2、本部分研究共包括pSS組患者42例,男性2例,女性40例,年齡19~65歲,平均年齡45.0±10.6歲;正常對(duì)照組41例,男性3例,女性38例,年齡27~58歲,平均年齡40.8±6.5歲。兩組年齡比無統(tǒng)

10、計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。FCM檢測(cè)pSS患者組外周血中CD3+CD247+細(xì)胞(TCR-ζ鏈)比例占40.7±30.1(%),正常對(duì)照組比例為57.1±17.8(%)。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示,pSS患者組TCR-ζ鏈水平較正常對(duì)照組低,且兩組之間存在顯著性差異(P<0.01)。通過RT-PCR驗(yàn)證,pSS組TCR-ζ鏈的相對(duì)表達(dá)量為0.2±0.1,正常對(duì)照組TCR-ζ鏈的相對(duì)表達(dá)量為1.0±0.6。pSS患者組TCR-ζ鏈的相對(duì)表達(dá)量低于正常

11、對(duì)照組,兩組△Ct值之間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　　3、本部分研究共檢測(cè)pSS組患者42例,平均年齡45.0±10.6歲,IL-33水平130.4±72.3(pg/ml),正常對(duì)照組16例,平均年齡40.2±6.6歲,IL-33水平72.4±40.6(pg/ml)。兩組進(jìn)行組間對(duì)比,年齡差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。pSS組患者血清IL-33的水平高于正常對(duì)照組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。將pSS組根

12、據(jù)血沉的數(shù)值(Erythrocytesedimentationrate,ESR)、血清免疫球蛋白(Immuneglobulin,Ig,包括IgG、IgA、IgM)的表達(dá)水平以及血清補(bǔ)體(Complementinbloodserum,C,包括C3、C4)的表達(dá)水平異常與否進(jìn)行分組后進(jìn)行組間對(duì)比以及相關(guān)性分析。結(jié)果顯示:外周血TCR-ζ鏈與血清IL-33水平之間無明顯相關(guān)性。血沉升高組IL-33水平高于血沉正常組(P<0.05);IgG升高

13、組IL-33水平高于IgG正常組(P<0.05),C3降低組IL-33水平高于C3正常組(P<0.05)。
　　結(jié)論：
　　1、通過利用Jurkat細(xì)胞系行體外刺激實(shí)驗(yàn)提示,CD3單克隆抗體刺激與T細(xì)胞的激活、TCR-ζ鏈水平的改變有直接聯(lián)系。在異常刺激下,T細(xì)胞異?；罨?TCR-ζ鏈水平隨著時(shí)間的延長而降低。
　　2、pSS的發(fā)病過程是免疫紊亂導(dǎo)致T/B細(xì)胞的異?；罨?而TCR-ζ鏈在T細(xì)胞異?；罨^程中起到重要的鏈

14、接作用。通過FCM檢測(cè)pSS患者組及正常對(duì)照組外周血中TCR-ζ鏈的水平,發(fā)現(xiàn)pSS患者組TCR-ζ鏈較正常對(duì)照組降低,兩組之間存在顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,說明TCR-ζ鏈在pSS的疾病發(fā)生過程中,不僅參與T細(xì)胞的異?；罨?亦可能與其病理改變過程相關(guān)。
　　3、ELISA法驗(yàn)證IL-33可能參與pSS疾病發(fā)生發(fā)展過程中的炎癥反應(yīng)。通過檢測(cè)pSS患者組及正常對(duì)照組血清中IL-33水平,完善臨床資料,將臨床上用于pSS疾病的常用指標(biāo)進(jìn)行對(duì)比分

15、析。通過統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn),IL-33水平與血沉、血清IgG水平、血清C3水平可能相關(guān)。TCR-ζ鏈水平與IL-33水平兩者無明顯相關(guān)性。
　　第二部分
　　背景：
　　干燥綜合征(SS)是一種慢性的,侵犯外分泌腺為主的,并可伴有多系統(tǒng)損害的炎癥性自身免疫病。SS的發(fā)病率很高。一直以來干燥綜合征在臨床上缺乏理想的特異性很高的血清學(xué)診斷方法,患者在行唇腺活檢等有創(chuàng)檢查時(shí)依從性較差,加上該病起病隱匿,社會(huì)認(rèn)識(shí)不足以及其缺乏典型癥狀等

16、均導(dǎo)致干燥綜合征的臨床診斷一直是一個(gè)難題。目前在自身抗體的血清學(xué)診斷中,抗核抗體ANA、抗SSA抗體及抗SSB抗體等雖然對(duì)干燥綜合征的診斷有一定意義,但是敏感性和特異性并不理想。近年來,國內(nèi)外的研究均表明α-胞襯蛋白與干燥綜合征的發(fā)病有關(guān),且更有研究表明抗α-胞襯蛋白抗體(anti-α-fordrinpolypeptideantibody)是干燥綜合征的特異性抗體。那么抗α-胞襯蛋白抗體的特異性和敏感性如何?在診斷SS的臨床工作中,我們

17、應(yīng)當(dāng)怎樣更好的聯(lián)合應(yīng)用各項(xiàng)檢查來更快的明確診斷呢?帶著這樣的問題,我們進(jìn)行了干燥綜合征中抗α-胞襯蛋白抗體的相關(guān)臨床研究。
　　目的：
　　探討抗α-胞襯蛋白抗體在檢測(cè)在干燥綜合征診斷中的意義,以加深臨床上對(duì)抗α-胞襯蛋白抗體檢測(cè)的了解并引起重視。
　　方法：
　　對(duì)在我院風(fēng)濕免疫實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行抗α-胞襯蛋白抗體檢測(cè)的105例住院病人的臨床資料進(jìn)行整理,并分干燥綜合征組(SS組)、干燥綜合征合并其他結(jié)締組織病組(合并

18、CTD組)、單純其他結(jié)締組織病組(其他CTD)和非結(jié)締組織病組(非CTD組)四組進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
　　結(jié)果：
　　抗α-胞襯蛋白抗體檢查在干燥綜合征患者中特異度67.1%,靈敏度40%,特異度均高于抗SSA抗體(35.7%)和抗SSB抗體(61.4%),靈敏度均低于抗SSA抗體(85.7%)和抗SSB抗體(71.4%)。對(duì)比四組之間,抗SSA抗體(P<0.01)、抗SSA抗體(P<0.01)、ENA譜(P<0.01)、IgA

19、(P<0.05)以及唾液腺ECT(P<0.01)檢測(cè)結(jié)果的差異性具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。同時(shí)將抗α-胞襯蛋白抗體檢測(cè)結(jié)果與抗SSA抗體、抗SSA抗體和(或)唾液腺ECT檢測(cè)結(jié)果聯(lián)合考慮,結(jié)果提示組間差異也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(1P<0.01,2P<0.05)。
　　結(jié)論：
　　抗α-胞襯蛋白抗體的檢測(cè)對(duì)于干燥綜合征診斷的特異性高于抗SSA抗體和抗SSB抗體,但其靈敏度均不及抗SSA抗體和抗SSB抗體。唾液腺ECT的檢查對(duì)于干燥綜合征的診斷具