肝素鈉中主要雜質(zhì)的NMR定量分析方法及污染肝素的分離技術(shù)研究.pdf

1、肝素鈉(Heparin Sodium，HP)是從豬小腸粘膜中提取出來的一種糖胺聚糖類抗凝血藥物，具有抗凝血和抗血栓形成的功能，還有抗炎、抗過敏、抑制平滑肌細(xì)胞增殖、抗病毒、抗腫瘤等多種生物學(xué)功能，是需要迅速達到抗凝作用的首選藥物，在臨床上得到廣泛應(yīng)用。
　　在2008年初，美國、歐洲等多個國家發(fā)生了嚴(yán)重的肝素鈉注射液不良反應(yīng)事件，引發(fā)數(shù)百例病人產(chǎn)生嚴(yán)重的過敏反應(yīng)，甚至導(dǎo)致了約百例病人死亡。肝素鈉事件在世界范圍內(nèi)引起了廣泛的探討與研

2、究，F(xiàn)DA分析結(jié)果表明：該事件與肝素鈉中存在的污染物多硫酸軟骨素(Oversulfated Chondroitin Sulfate，OSCS)有關(guān)。OSCS具有和肝素鈉相似的結(jié)構(gòu)、相對分子量范圍，常規(guī)的生物化學(xué)方法難以對其進行檢測。為了加強該類原料質(zhì)量監(jiān)督，建立一種快速有效的檢測HP中OSCS的方法十分重要。常規(guī)的1H-NMR雖可用于兩者的檢測，但存在檢出限(Limit of detection，LOD)、定量檢測限(Limit of

3、quantitmion，LOQ)高的缺點。
　　本文優(yōu)化了1H-NMR法檢測HP中的OSCS的實驗儀器條件：樣品濃度25mg/mL，定標(biāo)物TSP含量為0.020％(W/V)，樣品旋轉(zhuǎn)為10 Hz，窗函數(shù)線寬因子Lb為1.00Hz，采樣脈沖序列PULPROG為zg，馳豫延遲時間D1為4.00s，在此實驗條件另外，LOD為0.01％，比文獻報道提高了10倍。應(yīng)用峰高法和峰面積法對HP中雜質(zhì)OSCS進行了定量計算，結(jié)果表明峰高法的LOQ

4、為0.1％，比文獻報道提高了5倍。
　　污染肝素的分離純化技術(shù)可使已污染肝素的價值回歸。同時，肝素鈉中污染物OSCS的來源研究對以后肝素鈉的生產(chǎn)具有重要意義。
　　利用陰離子樹脂交換法分離肝素鈉與OSCS的研究。根據(jù)HP與OSCS的電荷數(shù)的不同，以離子交換法對兩者進行分離，采用單因素試驗研究了樹脂型號、樹脂用量等因素對兩者分離度的影響，最優(yōu)結(jié)果為：樹脂型號FBD202，樹脂用量20％，吸附時間4h，吸附PH9.5，吸附溫度5

5、5℃，鹽濃度15％。分離度達75％以上。
　　對肝素鈉中污染物OSCS來源的研究。從肝素鈉的主要原料豬小腸著手，將豬小腸分離為三部分(腸粘膜、腸衣、漿膜)，分別進行粘多糖組成分析，結(jié)果表明：三者均不含有OSCS，腸粘膜中主要成分是HP，而腸衣及漿膜中主要成分是硫酸皮膚素。
　　有機溶劑沉淀法分離提純肝素鈉的研究。肝素鈉粗品中含有多種類似物雜質(zhì)，如硫酸軟骨素(Chondroitin Sulfate，CS)及硫酸皮膚素(Derm

6、atan Sulfate，DS)，根據(jù)其在不同極性的溶劑中溶解度不同而進行分離，結(jié)果表明：乙醇、甲醇、丙酮三者均可分離提純HP，溶劑用量分別為：9.1％-28.69%，33.3%-41.2％，16.7％-33.3％。
　　此外，為了從一張核磁共振氫譜上得到更多有效信息，本文用核磁共振氫譜標(biāo)準(zhǔn)加入法對肝素鈉中有機殘留(乙醇、甲醇、丙酮)進行了研究，并初步建立了定量計算肝素鈉中有機殘留(乙醇、甲醇、丙酮)新方法，結(jié)果表明：丙酮的線性回