近紅外光譜分析技術(shù)在肝素鈉生產(chǎn)過程中的應(yīng)用研究.pdf

1、肝素是糖醛酸和葡萄糖胺及它們的衍生物連接而成的具有不同鏈長的線性多糖，是開發(fā)最早、臨床應(yīng)用最廣泛的糖胺聚糖類大分子藥物。這類藥物能夠參與、影響和調(diào)控人體代謝和生理功能，臨床上主要作為抗凝血藥物。此外，它還具有調(diào)血脂、抗炎、抗過敏以及免疫調(diào)節(jié)等重要功能。肝素是我國最重要的生化原料藥出口品種之一，占世界肝素原料藥貿(mào)易份額高達(dá)87％。肝素的生產(chǎn)過程主要是指從肝素原料的評價開始一直到肝素成品入庫的整個過程。在該過程中，多硫酸軟骨素（Oversu

2、lfatedChondroitinSulfate，OSCS）這一肝素結(jié)構(gòu)類似物，能夠引起嚴(yán)重的不良反應(yīng)，應(yīng)杜絕其摻入;肝素結(jié)構(gòu)的完整性是保持其生物活性的基礎(chǔ)，在生產(chǎn)中應(yīng)盡量避免肝素結(jié)構(gòu)的破壞;與肝素相結(jié)合的雜蛋白易產(chǎn)生過敏反應(yīng)，生產(chǎn)過程中必須盡量去除;醇沉環(huán)節(jié)是影響肝素產(chǎn)品質(zhì)量和收率的關(guān)鍵單元操作，應(yīng)嚴(yán)格控制。因此，尋找精準(zhǔn)質(zhì)量控制方法可為保證肝素鈉質(zhì)量，保障廣大人民的用藥安全提供重要的技術(shù)支持。但實現(xiàn)精準(zhǔn)控制的前提是對工藝過程的深刻理

3、解，這就需要有效的過程分析技術(shù)做保證。
　　 近紅外光譜分析技術(shù)（Near-infraredSpectroscopy，NIRS）作為一種快速、有效的過程分析方法，已經(jīng)在化工等領(lǐng)域的過程分析中驗證了其應(yīng)用價值，但是在肝素鈉等糖胺聚糖類藥物過程分析中的應(yīng)用還沒有研究。
　　 本文以肝素鈉的精制過程為研究對象，利用NIRS和化學(xué)計量學(xué)方法對肝素鈉原料中的雜質(zhì)OSCS及生產(chǎn)過程中離子交換、醇沉等關(guān)鍵單元操作的快速檢測技術(shù)進(jìn)行了研

4、究，并針對肝素鈉成品效價的測定進(jìn)行了近紅外光譜波段選擇的研究。為近紅外光譜法應(yīng)用于肝素鈉生產(chǎn)過程的質(zhì)量控制奠定了理論基礎(chǔ)。
　　 本課題研究內(nèi)容及取得的主要成果有以下幾個方面:
　　 1.NIRS用于肝素原料藥中OSCS的快速檢測方法研究
　　 本研究采用偏最小二乘β判別(PartialLeastSquaresBetaClassification，PLSBC)和K-最鄰近距離算法(K-nearestNeighbo

5、r，KNN)兩種模式識別方法分別對93份肝素鈉原料藥樣品(47份不含有OSCS的精品肝素鈉樣品，46份含有OSCS的肝素鈉樣品)的近紅外光譜進(jìn)行了定性判別分析，分別選擇34份不含有OSCS的精品肝素鈉樣品和34份含有OSCS的肝素鈉樣品建立定性分析模型，并利用剩余樣品對模型進(jìn)行驗證。PLSBC驗證結(jié)果表明當(dāng)OSCS的含量大于0.7％時，可以有效地判別出含有OSCS的肝素鈉樣品。KNN驗證結(jié)果表明所建KNN模型能夠100％正確判別樣品中是

6、否含有OSCS。為進(jìn)一步驗證不同含量OSCS與不含有OSCS的精品肝素鈉的關(guān)系，將不含有OSCS的精品肝素鈉作為A等級，并根據(jù)OSCS含量的不同，將含有OSCS的肝素鈉樣品劃分為5個含量等級，分別為B、C、D、E和F，OSCS含量等級判別時模型的判斷正確率達(dá)83.33％。以上結(jié)果表明，運用NIRS可鑒別肝素鈉樣品中是否含有OSCS，這可為實際生產(chǎn)中原料藥中是否含有OSCS提供可靠且快速的檢測方法。
　　 2.NIRS用于快速監(jiān)測

7、粗品肝素離子交換層析過程的研究
　　 本研究選取肝素離子交換純化過程流出液為對象，收集80份吸附過程樣品和76份洗脫過程樣品，采用偏最小二乘（PartialLeastSquares，PLS）算法分別建立吸附過程和洗脫過程流出液中肝素含量的NIRS定量分析模型。通過模型優(yōu)化，最終選取光譜特征點8666cm-1、7160cm-1、5365cm-1建立吸附過程肝素含量定量分析模型，驗證集預(yù)測均方根誤差(RMSEP)=0.29g/L，驗

8、證集相關(guān)系數(shù)Rp=0.957，驗證集標(biāo)準(zhǔn)偏差與預(yù)測標(biāo)準(zhǔn)偏差的比值RPD=3.4472;選取6098-5802cm-1這一波段范圍建立洗脫過程肝素含量定量分析模型，RMSEP=3.55g/L，Rp=0.9647，RPD=3.9849。并按照樣品批次將模型預(yù)測含量與參考值進(jìn)行比較，肝素含量測定的參考值和近紅外光譜模型預(yù)測值繪制的肝素含量變化趨勢基本接近。所建方法具有快速、無損等優(yōu)點，無需復(fù)雜的樣品前處理，可直接對流出液樣品進(jìn)行檢測，實現(xiàn)層析

9、過程的實時跟蹤。
　　 3.NIRS用于醇沉過程中肝素鈉含量的測定研究
　　 本研究通過模擬肝素鈉的醇沉過程，收集5批共80個醇沉過程樣品，離心后取上清，采集上清的近紅外光譜并測定其肝素含量。首先采用主成分分析(PrincipalComponentAnalysis，PCA)對醇沉過程進(jìn)行光譜的特征性分析，不同批次之間主成分的變化趨勢基本一致，第一主成分隨著時間的推移得分不斷的增加，揭示了乙醇量的不斷增加;第二主成分可以較

10、好的反應(yīng)醇沉體系的穩(wěn)定程度，開始向溶液中加入乙醇，肝素大量沉淀出來，體系的穩(wěn)定性被破壞，在30-40min時，溶液中肝素的含量變化曲線出現(xiàn)拐點，主成分的得分也相應(yīng)到達(dá)拐點;之后溶液中的肝素含量很低，體系又慢慢趨于穩(wěn)定。結(jié)果表明通過PCA得分圖的變化規(guī)律，可以很好地揭示整個肝素醇沉過程的變化趨勢。其次，采用一階導(dǎo)數(shù)SG15點平滑、交叉驗證選取3個主成分?jǐn)?shù)，在9034.87-8940.37cm-1、8649.17-8554.68cm-1、7

11、974.21-7686.87cm-1、7395.67-7301.18cm-1以及5949.32-5758.4cm-1的波數(shù)范圍建立肝素含量的PLS定量分析模型，絕對系數(shù)R2=0.974，交互驗證均方根誤差(RMSECV)=1.4089g/L，用建立的模型對結(jié)果進(jìn)行預(yù)測，RMSEP=1.1054g/L。實驗結(jié)果表明運用NIRS監(jiān)測醇沉母液中肝素含量準(zhǔn)確度和精密度均能滿足工廠需要。
　　 4.肝素鈉精品效價和近紅外光譜之間的關(guān)聯(lián)性研

12、究
　　 本研究對47份效價分布范圍在154-162IU/mg的肝素鈉精品進(jìn)行效價與近紅外光譜之間的關(guān)聯(lián)性探討。通過對肝素鈉精品的效價與近紅外光譜建立PLS模型，預(yù)測肝素鈉精品的效價，同時考察了相關(guān)系數(shù)法、間隔偏最小二乘法(intervalPLS，iPLS)、連續(xù)投影算法(SuccessiveProjectionsAlgorithm，SPA)三種波段選擇方法對模型預(yù)測能力的影響以及吸光度、效價、結(jié)構(gòu)之間的關(guān)系。結(jié)果表明相關(guān)系數(shù)法

13、所選擇的波段具有最佳的模型參數(shù)，Rp=0.8868，RMSEP=0.7925IU/mg，RMSECV=1.2786IU/mg。相關(guān)系數(shù)法選擇的波段分布范圍較廣，涵蓋C-H鍵振動的一級倍頻、二級倍頻、組合頻，1800-2100nm的強烈吸收是由于O-H鍵的組合頻引起，這些吸收區(qū)間均與肝素的結(jié)構(gòu)有很大相關(guān)性，包含了肝素結(jié)構(gòu)的諸多有效信息，因此相關(guān)系數(shù)法所選擇的波段能產(chǎn)生最優(yōu)的預(yù)測結(jié)果。
　　 本研究取得的主要創(chuàng)新性成果有以下幾個方面

14、:
　　 1.研究建立了利用近紅外光譜結(jié)合PLSBC法和KNN法鑒別肝素鈉原料藥中OSCS的方法;
　　 2.研究建立了利用近紅外光譜定量監(jiān)測粗品肝素離子交換過程肝素含量分析方法;
　　 3.研究建立了利用近紅外光譜定性和定量分析醇沉過程肝素鈉含量變化的方法;
　　 4.對肝素鈉精品效價和近紅外光譜之間的關(guān)聯(lián)性進(jìn)行了研究，優(yōu)化了近紅外光譜定量分析肝素鈉精品效價的模型。
　　 5.揭示了近紅外光譜與