塞來昔布對(duì)食管鱗癌P16、CDH1基因啟動(dòng)子CpG島甲基化的影響.pdf

1、目的:食管癌在我國是一種常見的惡性腫瘤，有著較高的死亡率。我國的食管癌發(fā)病率有較明顯的地區(qū)性，河北省中南部，河南省北部及太行山地域是食管癌世界發(fā)病率最高的地區(qū)。食管鱗癌是其主要的組織類型。食管癌的發(fā)生是由于多種癌基因的激活及抑癌基因的失活長(zhǎng)期協(xié)同作用的結(jié)果?；虍惓＜谆悄壳耙阎囊环N基因異常改變，與其他基因異常相比，基因的甲基化對(duì)腫瘤的基因治療研究有著重要的作用。DNA的甲基化在一定條件下具有可逆性，具有去甲基化的藥物可以使DNA的

2、甲基化發(fā)生去甲基化，從而使抑癌基因激活。
　　 目前已知，P16與CDH1基因都是重要的抑癌基因，P16直接參與細(xì)胞周期調(diào)控，定位于9p21染色體，在細(xì)胞周期G1/S限制點(diǎn)起關(guān)鍵負(fù)調(diào)控作用，調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖。CDH1基因編碼的E-鈣粘附蛋白屬于選擇性細(xì)胞識(shí)別與粘附的表面糖蛋白家族。有研究表明，CDH1的失活在上皮源性的腫瘤經(jīng)常發(fā)生。
　　 塞來昔布是一種非甾體類抗炎藥(Non-steroidal antiinflammat

3、ory drug，NSAIDS)，有研究表明非甾體抗炎藥(NSAIDs)有抑制腫瘤基因的甲基化的作用。本課題應(yīng)用MSP和RT-PCR方法檢測(cè)同一食管鱗癌患者服用塞來昔布之前和服用塞來昔布之后食管鱗癌組織中P16基因與CDH1基因啟動(dòng)子區(qū)域CpG島甲基化狀態(tài)，并應(yīng)用流式細(xì)胞學(xué)技術(shù)檢測(cè)用藥前后的細(xì)胞凋亡率，以揭示塞來昔布對(duì)食管鱗癌的抑制作用。
　　 方法:
　　 1、觀察組選取13例未服用過非甾體抗炎藥(NSAIDs)的食管

4、鱗癌患者的食管鱗癌組織，囑該食管鱗癌患者口服塞來昔布（400mg/次，2次/日）10-15天后，選取該患者新鮮手術(shù)食管鱗癌標(biāo)本。對(duì)照組選取19例未服用過非甾體抗炎藥(NSAIDs)的食管鱗癌患者的食管鱗癌組織，經(jīng)過10-15天術(shù)后，選取該患者新鮮手術(shù)食管鱗癌標(biāo)本。
　　 2、應(yīng)用MSP技術(shù)分別檢測(cè)P16基因與CDH1基因在未服用過非甾體抗炎藥(NSAIDs)的患者的食管鱗癌組織中的甲基化率。
　　 3、應(yīng)用MSP及RT-

5、PCR技術(shù)分析同一患者服用塞來昔布前后的P16、CDH1基因基因啟動(dòng)子區(qū)域CpG島甲基化情況及P16、CDH1基因mRNA的表達(dá)量。旨在揭示塞來昔布對(duì)食管鱗癌患者P16基因與CDH1基因啟動(dòng)子區(qū)域CpG島的甲基化影響。
　　 4、應(yīng)用流式細(xì)胞學(xué)技術(shù)檢測(cè)觀察組服用塞來昔布前后的細(xì)胞凋亡率，旨在證實(shí)塞來昔布去甲基化作用與細(xì)胞凋亡關(guān)系。
　　 結(jié)果:
　　 1、P16基因啟動(dòng)子區(qū)域CpG島甲基化情況
　　 在服

6、用塞來昔布之前的觀察組中基因啟動(dòng)子區(qū)域CpG島甲基化率為69％(9/13)，對(duì)照組基因啟動(dòng)子區(qū)域CpG島甲基化率為74％(14/19)。經(jīng)Fisher確切概率法得出x2=0.073，P=0.787＞0.05，二者之間無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。服用塞來昔布之后的觀察組去甲基化率為44％(4/9)。對(duì)照組未服用塞來昔布的去甲基化率為7％(1/14)。經(jīng)Fisher確切概率法得出x2=4.286，P=0.038＜0.05，二者之間顯著差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

7、。
　　 RT-PCR結(jié)果顯示P16mRNA在服用塞來昔布前后的食管鱗癌組織中的表達(dá)強(qiáng)度分別為0.3333±0.05966和0.6460±0.14309(t=-10.785，P=0.000＜0.05)，統(tǒng)計(jì)分析表明P16mRNA在服藥后的食管鱗癌組織中表達(dá)強(qiáng)度顯著高于未服藥的食管鱗癌組織，二者之間有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 2、CDH1基因啟動(dòng)子區(qū)域CpG島甲基化情況
　　 在服用塞來昔布之前的觀察組中基因啟動(dòng)子區(qū)域C

8、pG島甲基化率為54％(7/13)，對(duì)照組基因啟動(dòng)子區(qū)域CpG島甲基化率為57％(11/19)。經(jīng)Fisher確切概率法得出x2=o.050，P=0.823＞0.05，二者之間無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。服用塞來昔布之后的觀察組去甲基化率為43％(3/7)。對(duì)照組未服用塞來昔布的去甲基化率為0％(0/11)。經(jīng)Fisher確切概率法得出x2=5.343，P=0.021＜0.05，二者之間顯著差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 RT-PCR結(jié)果顯示P

9、16mRNA在服用塞來昔布前后的食管鱗癌組織中的表達(dá)強(qiáng)度分別為0.3171±0.04582和0.6164±0.13150(t=-11.515，P=0.000＜0.05)，統(tǒng)計(jì)分析表明CDH1mRNA在服藥后的食管鱗癌組織中表達(dá)強(qiáng)度顯著高于未服藥的食管鱗癌組織，二者之間有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 3、流式細(xì)胞學(xué)結(jié)果
　　 觀察組服用塞來昔布前的食管鱗癌細(xì)胞凋亡率為12.32％±6.46％，服用塞來昔布后的食管鱗癌細(xì)胞凋亡率為19

10、.18％±6.09％，差值服從正態(tài)分布W=0.950，P=0.73＞0.1，經(jīng)配對(duì)T檢驗(yàn)t=-11.507，P=0.000，統(tǒng)計(jì)分析表明服藥后的食管鱗癌細(xì)胞凋亡率顯著高于服藥前，二者之間有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)論:
　　 1、P16、CDH1基因啟動(dòng)子區(qū)域CpG島在未服用塞來昔布的食管鱗癌患者的甲基化率明顯高于服用塞來昔布之后的患者。提示塞來昔布可以降低食管鱗癌患者P16、CDH1基因啟動(dòng)子區(qū)域CpG島甲基化。