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文檔簡介
1、目的:研究發(fā)現(xiàn)三種途徑可致抑癌基因失活。第一,基因內突變,第二,染色體變異,第三啟動子區(qū)DNA甲基化。啟動子區(qū)DNA甲基化是一個化學修飾過程,中間由酶介導,屬表觀遺傳學范疇。從而一些研究發(fā)現(xiàn),某些抑癌基因,如P14AR,DAP-K和TIMP-3等的表達和食管癌的發(fā)展與轉移有密切關系,基因啟動子區(qū)甲基化后導致抑癌基因失活,功能喪失,隨之患惡性腫瘤的幾率明顯增加。
近年來,NSAIDS(非甾體類抗炎藥),例如阿司匹林,吲哚美辛
2、,塞來昔布等,可以降低患胃腸道腫瘤的風險,現(xiàn)已成為腫瘤防治領域的熱點之一。流行病學研究顯示服用非甾體類抗炎藥能降低食管癌的死亡率。但是NSAIDS對食管癌甲基化的影響研究較少。本研究將觀察食管癌患者中P14ARF,DAP-K和TIMP-3等基因啟動子的甲基化情況與塞來昔布(選擇性抑制COX-2)對食管鱗癌P14ARF,DAP-K和TIMP-3等基因啟動子甲基化的影響。
方法:
1.研究標本:選2012年6月至
3、2013年1月河北醫(yī)科大學第四醫(yī)院胸三科食管上皮鱗狀細胞癌患者13例,男性9例,女性4例,男女比例9∶4,平均年齡60.85歲,患者術前、術后均經(jīng)病理證實為食管鱗狀細胞癌,均未行放化療,均未長期服用阿司匹林等非甾體類抗炎藥物,均無其他惡性腫瘤病史。實驗組:患者服藥前行胃鏡檢查并進行食管癌組織咬檢,后囑患者口服塞來昔布400mg/每次,2次/日,取術后大體病理標本。對照組:選取19例食管鱗癌患者,術前均未服用非甾體抗炎藥,經(jīng)術前各項檢查后
4、行食管癌根治術,術后選取該患者新鮮手術食管鱗癌標本。術前、術后取材時,標本離體后立即浸泡于事先準備好的later液中,并迅速轉移至-80℃冰箱貯存以備用。2將對照組與實驗組標本進行冰上研磨分別提取組織DNA與RNA,并置于-80℃冰箱保存以防降解。利用特異性甲基化PCR技術(MSP)對實驗組和對照組進行甲基化檢測,計算甲基化率,利用RT-PCR檢測實驗組中所測得P14ARF、DAP-K和TIMP-3基因啟動子甲基化的同一個體前后mRNA
5、表達。3檢測實驗組中服藥前后標本的凋亡率。4利用SPSS軟件對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析?;蚣谆癄顟B(tài)與其臨床病理學參數(shù)的關系應用x2檢驗;甲基化率采用Fisher確切概率法檢驗;mRNA的表達分析與凋亡率的比較采用配對t檢驗統(tǒng)計。
結果:
1.P14ARF、DAP-K和TIMP-3基因啟動子甲基化狀態(tài)及其與臨床病理學參數(shù)的關系
P14ARF、DAP-K和TIMP-3基因啟動子在食管鱗狀細胞癌組織中
6、的甲基化率分別為38.4%、46.1%和30.8%。P14ARF基因啟動子甲基化狀態(tài)與患者的年齡、性別無關(P均>0.05),與有無淋巴結轉移(x2=5.468,P=0.019)有關。DAP-K基因甲基化狀態(tài)與患者的年齡、性別及有無淋巴結轉移(P均>0.05)均無關。TIMP-3基因甲基化狀態(tài)與患者的年齡和性別無關(P均>0.05),與有無淋巴結轉移有關(x2=5.468,P=0.019)。
2.實驗組與對照組中P14AR
7、F、DAP-K和TIMP-3基因啟動子區(qū)甲基化情況
實驗組中服藥前P14ARF基因啟動子甲基化率為38.5%(5/13),對照組中甲基化率為47.4%(9/19),經(jīng)塞來昔布處理后的去甲基化率為60%(3/5),對照組去甲基化率為0%(0/9),經(jīng)Fisher確切概率法統(tǒng)計,x2=6.382,P=0.027<0.05,差異有統(tǒng)計學意義。實驗組中服藥前DAP-K基因啟動子甲基化率為46.1%(6/13),對照組中甲基化率為5
8、7.9%(11/19),經(jīng)塞來昔布處理后的去甲基化率為50%(3/6),對照組去甲基化率為0%(0/11),經(jīng)Fisher確切概率法統(tǒng)計,x2=6.286,P=0.029<0.05,差異有統(tǒng)計學意義。實驗組中服藥前TIMP-3基因啟動子甲基化率為30.8%(4/13),對照組中甲基化率為36.8%(7/19),經(jīng)塞來昔布處理后的去甲基化率為50%(2/4),對照組去甲基化率為0%(0/9),經(jīng)Fisher確切概率法統(tǒng)計,x2=3.889
9、,P=0.049<0.05,差異有統(tǒng)計學意義。
3.塞來昔布處理前后P14ARF、DAP-K和TIMP-3基因mRNA表達量的比較
經(jīng)塞來昔布處理后P14AR基因mRNA的相對灰度值為0.56±0.046,明顯高于經(jīng)塞來昔布處理前的相對灰度值0.37±0.051,差異具有統(tǒng)計學意義(t=12.290P=0.000)。經(jīng)塞來昔布處理后DAP-K基因mRNA的相對灰度值為0.53±0.117,明顯高于經(jīng)塞來昔布處
10、理前的相對灰度值0.37±0.051,差異具有統(tǒng)計學意義(t=4.455P=0.011)。經(jīng)塞來昔布處理后TIMP-3基因mRNA的相對灰度值為0.50±0.095,明顯高于經(jīng)塞來昔布處理前的相對灰度值0.38±0.049,差異具有統(tǒng)計學意義(t=4.600P=0.019)。
4.經(jīng)塞來昔布處理前后細胞凋亡情況
經(jīng)塞來昔布處理前食管癌組織總體凋亡率為12.32±6.46%,經(jīng)塞來昔布處理后食管癌組織總體凋亡率
11、為19.18±6.09%,經(jīng)配對t檢驗統(tǒng)計t=-11.507,P=0.000<0.05,差異有統(tǒng)計學意義。
結論:
1.塞來昔布可以降低P14ARF、DAP-K和TIMP-3基因啟動子區(qū)甲基化程度。
2.塞來昔布可以提高P14ARF、DAP-K和TIMP-3基因在食管鱗狀細胞癌中的表達。
3.DAP-K基因甲基化狀態(tài)與患者年齡、性別及淋巴結轉移無關,P14ARF和TIMP-3基因與
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