臍帶血干細(xì)胞及臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)失代償期肝炎后肝硬化患者肝臟功能恢復(fù)的研究.pdf

1、近年來，患者自體骨髓干細(xì)胞移植在肝硬化治療中的良好效果已經(jīng)得到認(rèn)可，但該治療方法存在諸多限制，比如:采集過程痛苦，數(shù)量不足，分化能力不足等。體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)提示臍血干細(xì)胞及臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞在自我更新，增殖分化和擴(kuò)增潛能方面均優(yōu)于骨髓干細(xì)胞。本研究的目的是建立分離臍血干細(xì)胞及臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞分離培養(yǎng)的方法，并觀察兩者植入對(duì)失代償期肝炎后肝硬化的臨床效果，以尋求一種安全、有效的治療肝炎后肝硬化的方法。
　　第一步無菌條件下采用負(fù)收集法分離臍

2、血干細(xì)胞，同時(shí)采用酶消化法分離臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞。觀察兩種干細(xì)胞的形態(tài)，并通過流式細(xì)胞儀進(jìn)行進(jìn)一步鑒定。
　　第二步選擇47例失代償期肝炎后肝硬化患者，在抗病毒治療的基礎(chǔ)上，其中臍血干細(xì)胞治療組（27例），將臍血干細(xì)胞通過肝固有動(dòng)脈介入和靜脈輸注途徑植入。臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞治療組（20例），采用同樣方法植入。
　　觀察干細(xì)胞植入前和植入后半個(gè)月、1個(gè)月、3個(gè)月及6個(gè)月時(shí)患者血清學(xué)指標(biāo)改變，主要包括肝功能指標(biāo):血漿白蛋白水平(AL

3、B)、總膽紅素(TBIL)水平及血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)，血常規(guī)指標(biāo):血小板(PLT)、白細(xì)胞(WBC)及凝血功能指標(biāo):凝血酶原時(shí)間(PT)，腫瘤標(biāo)記物:甲胎蛋白(AFP)。并對(duì)患者治療前及治療后3個(gè)月B超結(jié)果進(jìn)行比較，同時(shí)觀察患者臨床癥狀、體征（乏力、納差、肝病面容、蜘蛛痣等）改善情況和術(shù)后不良反應(yīng)。
　　采集的臍血量約為110ml(100-130ml)，通過負(fù)收集法單份臍血可分離獲得干細(xì)胞平均數(shù)為2.31

4、×108。倒置顯微鏡下觀察，細(xì)胞分布均勻，大小均勻，呈圓形，透亮，折光性強(qiáng)，細(xì)胞活性＞95％。流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果:CD34+細(xì)胞占0.23％，活率為72.71％。無細(xì)胞污染事件發(fā)生。
　　通過酶消化法，從臍帶組織中成功獲得間充質(zhì)干細(xì)胞，細(xì)胞分離培養(yǎng)至貼壁生長(zhǎng)至80-90％融合約需10-14天。后大約3-5天傳代一次。倒置顯微鏡下觀察，原代細(xì)胞呈扁平條索狀。P1、P2、P3、P4代細(xì)胞形態(tài)觀察:細(xì)胞形態(tài)較均一，折光度好。細(xì)胞膜表面有

5、小的突起，胞核位于胞體的中央，為圓形或橢圓形，胞質(zhì)豐富，呈成纖維樣細(xì)胞形態(tài)，平行排列生長(zhǎng)或渦旋狀生長(zhǎng)。
　　在臍血干細(xì)胞治療組中我們發(fā)現(xiàn)，術(shù)前與術(shù)后3個(gè)月、6個(gè)月AST、TBIL、CHE和ALB水平比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05）。白細(xì)胞計(jì)數(shù)在第3個(gè)月后顯著增加(P＜0.05），第6個(gè)月出現(xiàn)下降。血小板計(jì)數(shù)無明顯變化，但逐漸改善。AFP在第3個(gè)月較治療前有明顯差異(P＜0.05)，第6個(gè)月出現(xiàn)下降。細(xì)胞植入后3個(gè)月左右行腹

6、部超聲檢查，門靜脈直徑減小13例，增大12例，不變2例。脾臟厚度16例減小，11例增大。在治療過程中無臟器衰竭及急性或慢性GVHD的病例。發(fā)熱病例4例，皮疹3例。植入細(xì)胞半個(gè)月，患者的精神、飲食改善明顯。腹脹、乏力不適好轉(zhuǎn)。植入后6個(gè)月者腹腔積液減少率為81.48％(22/27)，食欲、乏力好轉(zhuǎn)率為88.89％(24/27)，肝掌及蜘蛛痣減輕率為51.85％(14/27)。
　　臍帶間充質(zhì)治療組，術(shù)前與術(shù)后ALB水平在第1個(gè)月即有

7、顯著差異（P＜0.05），持續(xù)到第6個(gè)月。術(shù)后3個(gè)月，6個(gè)月時(shí)AST、TBIL和PT水平較術(shù)前比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。白細(xì)胞及血小板計(jì)數(shù)無顯著變化，但逐漸改善。AFP水平術(shù)后第1個(gè)月，第3個(gè)月較術(shù)前比較，有顯著性差異(P＜0.05），第6個(gè)月下降，無顯著性差異?；颊呒?xì)胞植入后3個(gè)月左右行腹部超聲檢查，門靜脈直徑減小7例，增大9例，不變4例。脾臟厚度11例減小，9例增大。在治療過程中無臟器衰竭病例，無急性或慢性GVHD的

8、病例。發(fā)熱病例8例。植入細(xì)胞半個(gè)月后，腹脹、乏力不適逐漸緩解，食欲較輸注前好轉(zhuǎn)。植入后6個(gè)月，患者腹水減少率為80％(16/20)，腹脹、乏力不適改善率90％(18/20)，肝掌及蜘蛛痣減輕率為50％(10/20)。通過兩種治療方案對(duì)患者臨床癥狀及體征、腹部B超結(jié)果（門靜脈直徑、腹水、脾臟厚度）有效率的分析，兩種治療方法無明顯差異（P＞0.05）。
　　總之，臍血干細(xì)胞分離及臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞分離培養(yǎng)方法安全、高效、穩(wěn)定，兩者對(duì)失代