長(zhǎng)期乙醇攝入對(duì)大鼠胃黏膜上皮細(xì)胞免疫因子TSLP表達(dá)的研究.pdf

1、第一部分:大鼠胃黏膜上皮氧化應(yīng)激狀態(tài)的建立及機(jī)制。
　　研究背景:
　　大量飲酒與胃腸道疾病相關(guān)，長(zhǎng)期適量飲酒對(duì)胃腸道的影響尚待研究。
　　高濃度乙醇對(duì)胃黏膜損害的動(dòng)物模型較為容易建立，長(zhǎng)期適量乙醇攝入對(duì)胃黏膜的影響的動(dòng)物模型鮮有報(bào)道。
　　Benjiamin Taylor[7]通過(guò)系統(tǒng)性回顧研究對(duì)于長(zhǎng)期適度飲酒對(duì)胃腸的作用和影響得出結(jié)論:適量的乙醇攝入對(duì)于疾病發(fā)展起消極、積極的作用，總得來(lái)說(shuō)適量乙醇攝入不是胃腸

2、疾病發(fā)展的高危因素。Taylor B把適量飲酒定義為每天乙醇攝入約為10-40g/d，據(jù)此我們給予Wistar大鼠乙醇15％(V/V)1ml/d灌胃，相對(duì)于適量攝入乙醇量。
　　流行病學(xué)研究[8]表明適量飲酒是肝病、食管腫瘤、胰腺炎的危險(xiǎn)因素，但是對(duì)于慢性胃炎、膽囊結(jié)石卻有積極意義，機(jī)制并不明確。人體中95％左右乙醇分解是通過(guò)氧化途徑進(jìn)行，包括乙醇的首過(guò)代謝(first-pass metabolism，F(xiàn)PM)，微粒體乙醇氧化體系

3、(microsomal ethanol-oxidizing system，MEOS)，脂肪酸過(guò)氧化氫酶(catalase)，乙醛脫氫酶(aldehydede hydrogenase，ALDH)[9]。乙醇首過(guò)代謝[10]是指一定量的乙醇攝入后進(jìn)入系統(tǒng)循環(huán)之前在胃和肝中代謝。Lieber[11]等廣泛的研究了這種現(xiàn)象，他們提出FPM主要發(fā)生在胃組織，胃黏膜乙醇脫氫酶起重要作用。ADH和ALDH途徑是乙醇代謝的主要途徑，ADH介導(dǎo)乙醇氧化，

4、使底物乙醇上的氫轉(zhuǎn)移到輔酶NAD上，轉(zhuǎn)化為NADH，產(chǎn)生底物乙醛。乙醛利用輔酶NAD在ALDH作用下轉(zhuǎn)化為乙酸，產(chǎn)生NADH。乙酸轉(zhuǎn)化為乙酰輔酶A，進(jìn)入三羧酸循環(huán)，最終分解為二氧化碳和水。
　　隨著酒精攝入量的增加和蓄積微粒體乙醇氧化系統(tǒng)參與乙醇氧化代謝，活性氧(reactive oxygen species，ROS)、氧自由基(oxygen free radical，OFR)隨之產(chǎn)生，包括線粒體在內(nèi)的細(xì)胞膜性系統(tǒng)出現(xiàn)脂質(zhì)過(guò)氧化，

5、細(xì)胞進(jìn)入氧化應(yīng)激(oxidative stress，OS)狀態(tài)[12]，轉(zhuǎn)錄因子缺氧誘導(dǎo)因子-1a表達(dá)增加，從而引起細(xì)胞處于乏氧適應(yīng)狀態(tài)，以及新的功能。而免疫功能也會(huì)發(fā)生改變，以適應(yīng)細(xì)胞內(nèi)低氧的環(huán)境。
　　1992年，Semenza，Wang首先發(fā)現(xiàn)了HIF1蛋白。HIF1是異源二聚體蛋白，由HIF1-α和HIF1-β組成，在缺氧條件下HIF1α迅速表達(dá)。一旦激活，HIF1α加強(qiáng)基因轉(zhuǎn)錄，包括幾乎所有的參與糖酵解的酶，增強(qiáng)細(xì)胞糖酵

6、解能力[13]。HIF1α激活丙酮酸脫氫酶激酶，抑制線粒體丙酮酸脫氫酶復(fù)合體，減少進(jìn)入三羧酸循環(huán)的丙酮酸量。進(jìn)入三羧酸循環(huán)的丙酮酸減少，減少缺氧狀態(tài)下氧化磷酸化及氧耗量。
　　HIF1α參與免疫的調(diào)節(jié)。
　　胸腺基質(zhì)淋巴細(xì)胞生成素(thymic stromal lymphopoietin，TSLP)源于細(xì)胞上皮的一種淋巴因子，可以直接作用于黏膜中樹(shù)突細(xì)胞(dendritic cells，DCs)[14，15]。使后者分泌OX

7、40L促使TH0細(xì)胞向TH2細(xì)胞極化，形成TH2免疫。
　　正常胃黏膜上皮中存在DCs。TSLP是抗炎因子。
　　TSLP是否在正常胃黏膜中表達(dá)，尚未有研究。
　　目的與方法:
　　我們研究長(zhǎng)期乙醇攝入后大鼠胃黏膜病理形態(tài)變化，胃黏膜丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量變化及胃黏膜損傷程度，探討胃黏膜上皮細(xì)胞在缺氧狀態(tài)下，脂質(zhì)過(guò)氧化與上皮損傷的關(guān)系。我們分別用15％、30％、45％不同濃度乙醇灌胃

8、制備胃黏膜上皮氧化狀態(tài)模型，觀察胃黏膜大體及鏡下形態(tài)學(xué)變化并評(píng)估黏膜損傷指數(shù)(lesion index，LI)，硫代巴比妥酸法(thiobarbituric acid，TBA)測(cè)定胃黏膜內(nèi)MDA含量，MDA與LI、病理?yè)p傷積分的關(guān)系。
　　結(jié)果:
　　我們發(fā)現(xiàn)(1)15％乙醇攝入組，3、6、9周后黏膜損傷指數(shù)、病理?yè)p傷積分、及MDA數(shù)量分別與對(duì)照組相比，均沒(méi)有顯著變化。(P＞0.05，n=9)(2)30％、45％組胃黏膜損傷

9、指數(shù)與胃黏膜MDA含量呈正相關(guān)，隨著乙醇濃度的升高及作用時(shí)間的延長(zhǎng)，胃黏膜MDA含量增加，胃黏膜損傷程度加重(p＜0.01，n=9)。
　　結(jié)論:
　　對(duì)于大鼠5ml/kg/d15％v/v乙醇攝入后，大鼠胃黏膜上皮細(xì)胞氧化應(yīng)激狀態(tài)不明顯。
　　隨著濃度升高、攝入時(shí)間延長(zhǎng)，長(zhǎng)期乙醇攝入可引起胃黏膜上皮細(xì)胞脂質(zhì)過(guò)氧化，細(xì)胞整體上處于缺氧狀態(tài)。
　　第二部分:氧化應(yīng)激狀態(tài)下大鼠胃黏膜上皮細(xì)胞免疫因子表達(dá)的研究。

10、　　研究背景:
　　細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)代謝與細(xì)胞免疫是細(xì)胞內(nèi)兩種不同的功能。乙醇在胃黏膜上皮細(xì)胞代謝后是否能夠影響胃黏膜上皮細(xì)胞的功能，尚未有研究。
　　乙醇與胃黏膜的關(guān)系主要集中于損傷與修復(fù)的關(guān)系。
　　長(zhǎng)期乙醇攝入經(jīng)過(guò)胃黏膜上皮的首過(guò)代謝作用、微粒體乙醇氧化系統(tǒng)作用，胃黏膜上皮細(xì)胞細(xì)胞膜出現(xiàn)脂質(zhì)過(guò)氧化及大量活性氧產(chǎn)生，細(xì)胞內(nèi)固有還原劑NADPH減少，細(xì)胞為適應(yīng)常氧到缺氧環(huán)境的變化，轉(zhuǎn)錄因子缺氧誘導(dǎo)因子-1alpha(HIF

11、-1α)功能增強(qiáng)，增強(qiáng)細(xì)胞缺氧耐受。HIF-1α是1992年發(fā)現(xiàn)的一種重要轉(zhuǎn)綠因子，HIF-1α的下游靶基因目前有超過(guò)200個(gè)，參與能量代謝、血管新生、一氧化氮合成、鐵與血紅素代謝以及免疫調(diào)節(jié)[27]。胸腺基質(zhì)淋巴細(xì)胞生成素(thymic stromal lymphopoietin，TSLP)是一種上皮細(xì)胞來(lái)源的細(xì)胞因子，作用于髓樣和淋巴樣樹(shù)突細(xì)胞，調(diào)節(jié)適應(yīng)性免疫，在起始和促進(jìn)Th2細(xì)胞免疫過(guò)程中起重要作用。TSLP與樹(shù)突細(xì)胞上TSLP

12、R直接作用，通過(guò)CD40L促使Th0極化為T(mén)h2細(xì)胞，形成體液免疫，參與對(duì)胞外菌及寄生蟲(chóng)清除。其激活途徑是獨(dú)立于MCHII分子、共刺激分子之外的另一條途徑。TSLP是否在胃黏膜上皮中表達(dá)，以及其表達(dá)的機(jī)制尚未有人研究。我們?cè)O(shè)想在長(zhǎng)期乙醇攝入條件下HIF-1α被激活，其靶基因TSLP表達(dá)。豐富黏膜免疫理論，為適量飲酒可以有助于清除幽門(mén)螺旋桿菌(Helicobacter pylori，HP)提供理論支持。
　　目的:
　　1.建

13、立適量飲酒的大鼠動(dòng)物模型。
　　2.大鼠胃胃黏膜上皮能否表達(dá)TSLP，以及表達(dá)量是否與攝入乙醇量、時(shí)間有關(guān)系。
　　3.轉(zhuǎn)錄因子HIF-1α是否調(diào)控TSLP表達(dá)。
　　材料與方法:
　　選用健康雄性Wistar大鼠33只，按照不同濃度分為3組，分別給予生理鹽水、15％、45％乙醇灌胃，8％水合氯醛1ml麻醉后給予取出胃黏膜，用RT-PCR檢查各組HIF-1α、TSLPmRNA相對(duì)表達(dá)量，免疫組化進(jìn)行蛋白定位，We

14、sternblot技術(shù)測(cè)定細(xì)胞內(nèi)HIF-1α、TSLP表達(dá)量并進(jìn)行相關(guān)性分析。
　　統(tǒng)計(jì)方法:
　　SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用單因素方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，以P＜0.05為顯著性差異。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果
　　生理鹽水組大鼠胃黏膜mRNA水平檢測(cè)到HIF-1α，未檢測(cè)到TSLP。蛋白質(zhì)水平未檢測(cè)到HIF-1a、TSLP。15％，45％組mRNA水平、蛋白質(zhì)水平均有HIF-1α、TSL