正常氧干預(yù)對(duì)不同程度間歇缺氧大鼠腦組織損傷影響的研究.pdf

1、研究目的：
　　通過建立不同程度的間歇缺氧動(dòng)物模型，模擬不同程度睡眠呼吸暫停低通氣綜合征(SAHS)患者的缺氧狀態(tài)，研究不同程度間歇缺氧對(duì)大鼠腦細(xì)胞凋亡發(fā)生發(fā)展的意義;對(duì)缺氧動(dòng)物模型實(shí)施21％氧干預(yù)后，觀察其對(duì)腦組織病理變化的影響，加深對(duì)SAHS的認(rèn)識(shí)，為早期干預(yù)SAHS病情的發(fā)生與發(fā)展提供科學(xué)依據(jù);觀察對(duì)間歇缺氧進(jìn)行21％氧干預(yù)后，大鼠腦內(nèi)HIF-1，iNOS表達(dá)的變化，探討二者在間歇缺氧神經(jīng)細(xì)胞凋亡中的作用，同時(shí)闡明這一變化對(duì)

2、評(píng)估缺血性腦血管疾病的治療價(jià)值的意義。
　　材料與方法：
　　健康SD大鼠42只，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。實(shí)驗(yàn)起始階段:42只中隨機(jī)選取6只作為0周的參考值（A組）。剩余36只大鼠隨機(jī)分為三組，對(duì)照組(n=12);輕度間歇缺氧組（n=12，相當(dāng)于輕度OSAS，AHI=15）;重度間歇缺氧組(n=12，相當(dāng)于重度OSAS，AHI=40)，各組以普通飼料、普通飲水飼養(yǎng)60天。每日9:00至16:00時(shí)將各組大鼠置于各實(shí)驗(yàn)箱中，共7h，1

3、6:00后使大鼠生活于大氣環(huán)境中。各組在試驗(yàn)30天后隨機(jī)取6只大鼠（BN組，BQ組，BZ組），予以取腦、原位細(xì)胞凋亡檢測(cè)(TUNEL)、電鏡檢查，應(yīng)用免疫組化，Western Blot對(duì)腦內(nèi)HIF-1α，iNOS進(jìn)行蛋白水平的檢測(cè)。各組剩余大鼠（CN組，CQ組，CZ組）予以正常氧環(huán)境下繼續(xù)飼養(yǎng)，30天后行上述相同檢查。結(jié)果應(yīng)用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。
　　結(jié)果：
　　1.神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化:
　　1.1 HE

4、染色光學(xué)顯微鏡下，神經(jīng)細(xì)胞核呈藍(lán)黑色，胞漿呈淡紅色。A組，BN組SD大鼠海馬區(qū)可見數(shù)層錐體神經(jīng)元，細(xì)胞形態(tài)規(guī)則;BQ，BZ各組中，從形態(tài)學(xué)觀察有不同程度的改變，海馬區(qū)錐體神經(jīng)元出現(xiàn)核固縮、胞質(zhì)濃縮、細(xì)胞體急劇變小等現(xiàn)象，以此判斷可能有細(xì)胞凋亡的發(fā)生。經(jīng)過21％氧干預(yù)30天后，試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn):干預(yù)組（CQ，CZ組）神經(jīng)細(xì)胞凋亡情況有所好轉(zhuǎn)，但部分神經(jīng)元細(xì)胞仍有排列不規(guī)則，形態(tài)改變的情況，未能恢復(fù)至初始水平。
　　1.2透視電鏡檢查發(fā)現(xiàn)

5、:經(jīng)過30天間歇缺氧，間歇缺氧組的腦組織病理較正常氧組有顯著變化，且重度間歇缺氧組較輕度間歇缺氧組改變更為明顯，表現(xiàn)為大鼠腦組織神經(jīng)細(xì)胞核雙層膜結(jié)構(gòu)破壞，部分線粒體水腫擴(kuò)張，細(xì)胞質(zhì)中可見空泡。經(jīng)過21％氧干預(yù)30天后，干預(yù)組神經(jīng)細(xì)胞凋亡情況有所好轉(zhuǎn)，但部分神經(jīng)細(xì)胞仍有細(xì)胞形態(tài)的變化，未能恢復(fù)至初始水平。
　　1.3 TUNEL實(shí)驗(yàn)顯示:對(duì)照組（A組，BN組）SD大鼠海馬區(qū)可見神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)規(guī)則，排列整齊緊密;缺氧組(BQ，BZ)中，

6、被染成棕黃色或棕褐色凋亡細(xì)胞增多，以重度間歇缺氧組增多最為明顯(14.83±2.48 VS18.67±2.66 VS32.67±4.18 VS49.17±4.36)。間歇缺氧組（BQ，BZ組）明顯高于對(duì)照組(A，BN組)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);輕度間歇缺氧組和重度間歇缺氧組之間兩兩比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。經(jīng)過21％氧干預(yù)30天后，試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn):間歇缺氧干預(yù)組（CQ，CZ組）神經(jīng)細(xì)胞凋亡情況有所好轉(zhuǎn)（24.00±

7、3.90 VS31.67±2.50），但未能恢復(fù)至初始水平。間歇缺氧干預(yù)組（CQ，CZ組）高于對(duì)照組（A，BN，CN組），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);和缺氧組（BQ，BZ組）之間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。凋亡神經(jīng)細(xì)胞主要集中在海馬區(qū)，皮層。
　　2.iNOS表達(dá)的比較
　　常氧對(duì)照組（A，BN組）大鼠腦組織內(nèi)散在分布少量iNOS陽性細(xì)胞（23.46±3.5501，24.17±1.4452）。在實(shí)驗(yàn)組，不論是

8、輕度間歇缺氧組還是重度間歇缺氧組均可見較多的著色細(xì)胞（37.01±4.0473，53.34±8.0801）。間歇缺氧組（BQ，BZ組）明顯高于對(duì)照組（A，BN組），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);輕度間歇缺氧組和重度間歇缺氧組之間兩兩比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);經(jīng)21％氧干預(yù)30天后，干預(yù)組（CQ，CZ組）腦內(nèi)iNOS陽性染色細(xì)胞表達(dá)恢復(fù)至初始水平（24.6±8.1662，24.77±6.6268），干預(yù)組（CQ，CZ組）和

9、間歇缺氧組(BQ，BZ組)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，和對(duì)照組（A，BN，CN組）比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。iNOS陽性染色細(xì)胞主要集中在大腦皮層及海馬區(qū)，不僅見于神經(jīng)元，神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中亦有表達(dá)。
　　WesternBlot檢測(cè)結(jié)果顯示:缺氧后，實(shí)驗(yàn)組（BQ，BZ組）iNOS較對(duì)照組(A，BN組)表達(dá)增多，以慢性重度間歇缺氧組最為明顯（140.01±1.7147 VS151.52±19.9948 VS376.52±38.92

10、34VS585.17±35.1067）。間歇缺氧組(BQ，BZ組)明顯高于對(duì)照組（A，BN組），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);輕度間歇缺氧組（BQ組）和重度間歇缺氧組（BZ組）之間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。經(jīng)21％氧干預(yù)30天后，干預(yù)組（CQ，CZ組:170.59±42.5984，172.45±30.2081）和間歇缺氧組（BQ，BZ組）比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，和對(duì)照組(A，BN，CN組)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05

11、)，各組腦內(nèi)iNOS蛋白表達(dá)恢復(fù)至初始水平。
　　3.HIF-1α表達(dá)的比較
　　常對(duì)照組（A，BN組）大鼠腦組織內(nèi)HIF-1α呈弱表達(dá)，在間歇缺氧組(BQ，BZ組)尤其是重度間歇缺氧組可見著色細(xì)胞明顯增多（12.35±4.7915 VS13.55±5.7289VS27.61±4.0600VS36.81±2.4887）。間歇缺氧組(BQ，BZ組)明顯高于對(duì)照組（A，BN組），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);輕度間歇缺氧組和

12、重度間歇缺氧組之間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義((P＜0.01);經(jīng)21％氧干預(yù)30天后，各組腦內(nèi)HIF-1α陽性染色細(xì)胞表達(dá)恢復(fù)至初始水平，干預(yù)組（CQ，CZ組:13.70±5.2587，14.22±6.5862）和間歇缺氧組（BQ，BZ組）比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，和對(duì)照組（A，BN，CN組）比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。HIF-1α陽性染色細(xì)胞主要集中在海馬及皮層區(qū)。
　　WesternBlot檢測(cè)結(jié)果顯示:缺氧后，實(shí)驗(yàn)組(BQ

13、，BZ組)HIF-1α較對(duì)照組（A，BN組）表達(dá)增多，以慢性重度間歇缺氧組最為明顯（112.60±11.2176 VS136.26±19.994VS338.25±81.6125 VS488.63±86.4614）。間歇缺氧組(BQ，BZ組)明顯高于對(duì)照組（A，BN組），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);輕度間歇缺氧組（BQ組）和重度間歇缺氧組（BZ組）之間兩兩比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。經(jīng)21％氧干預(yù)30天后，干預(yù)組（CQ，C

14、Z組:158.44±10.631，167.79±34.505）和間歇缺氧組（BQ，BZ組）比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，和對(duì)照組(A，BN，CN組)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，各組腦內(nèi)HIF-1α蛋白表達(dá)恢復(fù)至初始水平。
　　結(jié)論：
　　1.間歇缺氧易誘導(dǎo)腦內(nèi)特定部位神經(jīng)細(xì)胞凋亡，主要表現(xiàn)為皮層和海馬區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞凋亡增加，這可能是SAHS導(dǎo)致認(rèn)知功能障礙的主要原因。
　　2.不同缺氧方式所導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞凋亡的程度是不同

15、的，說明神經(jīng)細(xì)胞的凋亡不僅僅是由缺氧本身所致，而且與缺氧的方式有關(guān)。
　　3.間歇缺氧有效刺激海馬區(qū)iNOS和HIF-1α的蛋白水平高表達(dá)，二者共同參與了神經(jīng)系統(tǒng)缺氧應(yīng)答反應(yīng)。不同程度缺氧方式所導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞凋亡的程度是不同的，其HIF-1α及iNOS在腦內(nèi)的蛋白表達(dá)也不同。
　　4.缺氧干預(yù)后，腦組織損傷有一定程度的改善，可能與機(jī)體內(nèi)氧自由基代謝恢復(fù)平衡有關(guān)。缺氧程度不同，氧化應(yīng)激強(qiáng)度不同，早期糾正缺氧，改善氧化應(yīng)激狀態(tài)，可