缺血缺氧對腦組織和小膠質細胞的損傷機制及通心絡的干預作用.pdf

1、目的：缺血缺氧引起的腦損傷具有致殘率高、發(fā)病機制復雜等特點,雖然目前認為氧化應激和炎癥反應是缺血缺氧性腦損傷的重要原因，但其確切發(fā)病機制尚不十分清楚，藥物治療效果也不太理想。通心絡（TXL）膠囊系根據(jù)古代醫(yī)家絡病理論，以益氣活血、通絡止痛為治療原則研制而成的中藥復方制劑。通心絡在心血管疾病的臨床治療上應用廣泛且效果顯著；而且，各種臨床研究已證實，通心絡在老年腦動脈硬化、頭痛、腦梗死等腦血管疾病的治療上也取得了良好的療效。雖然，通心絡對缺

2、血缺氧性腦損傷具有保護作用，但其作用機制目前尚不清楚。本實驗研究在動物模型和細胞水平上研究通心絡對腦組織和小膠質細胞缺血缺氧性損傷的保護作用及其作用機制，為通心絡用于防治缺血缺氧性腦損傷提供有力的理論依據(jù)。
　　方法：選取雄性 ApoE-/-小鼠，隨機分為正常對照組、高脂飲食組和高脂+通心絡治療組。用高脂飼料飼喂ApoE-/-小鼠，制備動脈粥樣硬化誘發(fā)的腦缺血缺氧動物模型。通心絡治療組按7.5 mg/10 g體重每天給予通心絡超微

3、粉混懸液灌胃。對照組和高脂組每天灌服同等劑量的生理鹽水。連續(xù)灌注3個月后取材，TTC染色和HE染色檢查缺血性腦損傷動物模型是否成功。TTC染色是評價腦缺血損傷的常用指標，正常腦組織呈鮮紅色，梗死區(qū)腦組織呈蒼白色。利用Western blot和RT-PCR分析檢測腦組織HIF-1a、NRG-1、HO-1以及轉錄因子KLF5和KLF4的表達。在細胞水平上，用軟脂酸(C16:0）刺激神經(jīng)小膠質細胞（BV2）不同時間后，利用Western bl

4、ot和RT-PCR檢測細胞HIF-1a、NRG-1、HO-1以及轉錄因子KLF5和KLF4的表達。BV2細胞放入三氣培養(yǎng)箱中低氧培養(yǎng)不同時間，利用Western blot和RT-PCR檢測細胞HIF-1a、NRG-1、HO-1以及KLF5和KLF4的表達。細胞爬片經(jīng)免疫熒光染色檢查HIF-1a、NRG-1、HO-1、KLF5的表達。敲低KLF5，Western blot分析檢測HIF-1a、NRG-1、HO-1的表達。
　　結果：

5、⑴通心絡干預后，HIF-1a、NRG-1、HO-1的蛋白和mRNA水平均顯著下調。TTC染色結果可見，正常對照組腦組織均勻紅染；高脂飲食組可見明顯的梗塞區(qū)域；高脂飲食+通心絡組梗塞區(qū)域顯著減少。HE染色結果顯示，正常對照組腦組織形態(tài)結構正常，椎體細胞呈橢圓形，核仁明顯；高脂飲食組神經(jīng)元細胞高度水腫，呈空泡狀，細胞核濃染，固縮，梗塞中心區(qū)淡染，說明神經(jīng)元細胞嚴重損傷；通心絡組神經(jīng)元細胞損傷有所降低。以上結果表明，腦組織缺血模型制備成功。W

6、estern blot分析結果顯示，與正常對照組相比，高脂組HIF-1a、NRG-1、HO-1的表達明顯上調；與高脂組相比，高脂+通心絡組 HIF-1a、NRG-1、HO-1的表達顯著下調。這說明通心絡能部分逆轉缺血對 HIF-1a、NRG-1和 HO-1的誘導作用。RT-PCR分析結果發(fā)現(xiàn)，與正常對照組相比，高脂組HIF-1a、NRG-1、HO-1的mRNA水平升高，而與高脂組相比，高脂+通心絡組HIF-1a、NRG-1、HO-1的m

7、RNA水平明顯下降，這與Western blot結果相一致。⑵以BV2細胞作為研究對象，BV2細胞經(jīng)軟脂酸C16:0刺激不同時間后，Western blot分析結果顯示，HIF-1a、NRG-1、HO-1的蛋白表達隨著C16:0刺激時間的延長而增加； RT-PCR分析的結果也顯示，HIF-1a、NRG-1、HO-1的mRNA水平也隨著C16:0刺激時間的增加而升高。為了研究缺氧對BV2細胞的影響，BV2細胞放入三氣培養(yǎng)箱中進行低氧培養(yǎng)不

8、同時間，然后，Western blot分析結果顯示，低氧以時間依賴性的方式誘導HIF-1a、NRG-1和HO-1表達；用RT-PCR對HIF-1a、NRG-1和HO-1 mRNA進行檢測的結果與其蛋白質水平的變化趨勢相一致。用不同濃度的TXL預孵育BV2細胞24 h，然后再低氧培養(yǎng)36 h，Western blot分析結果顯示，通心絡能夠濃度依賴性的逆轉由缺氧誘導的HIF-1a、NRG-1、HO-1的上調；用RT-PCR對相應 mRNA

9、進行檢測的結果與其蛋白質水平變化的趨勢相一致。細胞免疫熒光染色結果也顯示，與對照組相比，缺氧條件下培養(yǎng)36 h后， HIF-1a、NRG-1、HO-1免疫熒光染色強度顯著增加，與通心絡預孵育后再進行缺氧培養(yǎng)，HIF-1a、NRG-1、HO-1免疫熒光染色強度顯著減少。這些結果表明，缺氧可以顯著誘導HIF-1a、NRG-1、HO-1表達，通心絡干預后，HIF-1a、NRG-1、HO-1的表達均顯著下調。⑶Western blot分析結果顯

10、示，與正常對照組相比，高脂組小鼠的KLF5表達明顯上調；與高脂組相比，高脂+通心絡組的KLF5的表達顯著降低。而與正常對照組相比，高脂組和高脂+通心絡組的KLF4的蛋白表達無明顯變化。用RT-PCR對KLF5和KLF4 mRNA進行分析的結果與其蛋白質水平的變化趨勢相吻合。這些結果說明，缺氧誘導HIF-1a、NRG-1、HO-1的表達可能與轉錄因子KLF5的表達上調有關。⑷在缺氧條件下培養(yǎng)BV2細胞，Western blot結果顯示，缺

11、氧以時間依賴的方式上調KLF5蛋白表達，但KLF4表達受缺氧影響不太明顯。用RT-PCR檢測KLF5和 KLF4 mRNA表達的結果與其蛋白水平的變化相一致。用不同濃度的TXL預孵育BV2細胞24 h后再缺氧培養(yǎng)36 h，由缺氧誘導的KLF5上調隨著TXL濃度的增加而逐漸逆轉，而KLF4隨著TXL濃度的變化其蛋白表達無明顯變化。同樣，mRNA水平的檢測結果與蛋白水平的變化趨勢相一致。細胞免疫熒光染色結果顯示，與對照組相比，缺氧36 h后

12、，KLF5免疫熒光染色強度顯著增加，通心絡預孵育能使KLF5免疫熒光染色強度顯著減少。這些結果表明，缺氧誘導HIF-1a、NRG-1和HO-1表達與其上調KLF5的表達有關。⑸由缺氧引起的HIF-1a、NRG-1、HO-1表達上調可能與轉錄因子 KLF5的表達有關。為了進一步探討 HIF-1a、NRG-1、HO-1的表達是否受KLF5的調控，我們用靶向小鼠的KLF5 siRNA轉染BV2細胞，敲低KLF5表達后，檢測HIF-1a、NRG

13、-1、HO-1的蛋白表達。Western blot分析結果顯示，KLF5缺失消除了缺氧誘導的HIF-1a、NRG-1、HO-1的表達上調。這些結果表明，在缺血缺氧的腦組織和BV2細胞中，KLF5介導缺氧誘導HIF-1a、NRG-1和HO-1表達。
　　結論：①腦組織缺血缺氧可以誘導HIF-1a、NRG-1、HO-1蛋白和mRNA的表達，通心絡干預后，HIF-1a、NRG-1、HO-1的蛋白和mRNA水平均顯著下調。②體外培養(yǎng)的BV