腦缺血再灌注神經(jīng)元損傷過程及心腦舒通膠囊干預(yù)作用環(huán)節(jié)的研究.pdf

1、腦血管病是臨床常見病、多發(fā)病，其發(fā)病率高、致殘率高、死亡率高，是嚴(yán)重危害人類健康的重大疾病之一。其中，缺血性腦血管病的發(fā)病在臨床更為多見，盡早的恢復(fù)腦血流和盡可能的逆轉(zhuǎn)受損的神經(jīng)細(xì)胞，是目前治療的重點(diǎn)。然而若不能及時(shí)恢復(fù)血流，則會(huì)引起腦缺血再灌注損傷，使病情加重。近來研究發(fā)現(xiàn)，腦血流中斷和血液再通使腦的組織、細(xì)胞產(chǎn)生損傷是一個(gè)動(dòng)態(tài)、快速發(fā)展的級(jí)聯(lián)反應(yīng)。這個(gè)損傷級(jí)聯(lián)反應(yīng)包括興奮性氨基酸毒性、能量代謝障礙、細(xì)胞內(nèi)鈣超載、炎癥反應(yīng)等多種病理機(jī)

2、制。 本研究選用在體大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷和離體培養(yǎng)神經(jīng)元缺氧/復(fù)氧損傷兩種模型，從整體和細(xì)胞水平入手，以神經(jīng)細(xì)胞凋亡和壞死的時(shí)空變化為切入點(diǎn)，動(dòng)態(tài)觀察腦缺血再灌注神經(jīng)元損傷過程的時(shí)空變化規(guī)律；選用臨床有效藥物心腦舒通膠囊對(duì)腦缺血再灌注神經(jīng)元損傷進(jìn)行干預(yù)，觀察氧自由基、炎性因子、細(xì)胞骨架、細(xì)胞內(nèi)鈣和凋亡調(diào)控因子等指標(biāo)變化，結(jié)合形態(tài)學(xué)了解腦組織病理改變，探討心腦舒通膠囊對(duì)腦缺血再灌注神經(jīng)元損傷的保護(hù)作用以及其可能的作用環(huán)節(jié)。與

3、此同時(shí)，聯(lián)系中醫(yī)“毒損腦絡(luò)”假說，進(jìn)一步從腦缺血再灌注損傷的病理生理過程和心腦舒通膠囊保護(hù)作用機(jī)制兩方面，為中醫(yī)“毒損腦絡(luò)”假說提供現(xiàn)代科學(xué)依據(jù)，豐富和完善腦缺血的中醫(yī)基礎(chǔ)理論。 實(shí)驗(yàn)包括以下三部分： 第一部分：大鼠腦缺血再灌注損傷后腦組織形態(tài)學(xué)與細(xì)胞凋亡時(shí)空變化規(guī)律的研究 目的：探討腦缺血1.5小時(shí)后再灌注不同時(shí)間，大鼠腦組織不同部位的病理損傷與神經(jīng)細(xì)胞凋亡的動(dòng)態(tài)變化。 方法：采用線栓法致大鼠大腦中動(dòng)脈

4、阻塞建立局灶性腦缺血再灌注模型。隨機(jī)分為：假手術(shù)組，腦缺血1.5h后再灌注3h、6h、12h、24h、48h、72h各組，共7組。HE染色和尼氏染色觀察腦組織形態(tài)學(xué)變化和損傷狀況；透射電鏡觀察神經(jīng)細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)改變；TUNEL法測定腦缺血損傷區(qū)神經(jīng)細(xì)胞凋亡的表達(dá)。 結(jié)果：腦缺血1.5h再灌注不同時(shí)間，大鼠腦組織內(nèi)出現(xiàn)不同程度的病理損傷和神經(jīng)細(xì)胞凋亡，形態(tài)學(xué)上觀察損傷部位以大腦皮層和尾殼核多見。HE染色和尼氏染色發(fā)現(xiàn)神經(jīng)元細(xì)胞間隙增

5、寬，水腫明顯，有核固縮等現(xiàn)象；透射電鏡亦發(fā)現(xiàn)神經(jīng)元水腫，可見凋亡小體。腦組織病理損傷趨勢在再灌注12h～48h內(nèi)最為顯著。TUNEL結(jié)果發(fā)現(xiàn)神經(jīng)細(xì)胞凋亡以再灌注12h～48h時(shí)較明顯，再灌注24h時(shí)凋亡達(dá)最高峰。其中皮層損傷范圍較廣，細(xì)胞凋亡較多。 第二部分：心腦舒通膠囊對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用及機(jī)制研究 目的：從腦缺血再灌注損傷后氧自由基、炎性因子、細(xì)胞骨架、凋亡調(diào)控因子等幾 個(gè)方面的變化著手，結(jié)合形態(tài)

6、學(xué)了解腦組織病理改變，研究心腦舒通膠囊對(duì)腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用及其可能的作用機(jī)制。 方法：采用線栓法致大鼠大腦中動(dòng)脈阻塞建立局灶性腦缺血再灌注模型。隨機(jī)分為3組：假手術(shù)組，腦缺血1.5h后再灌注24h模型組，心腦舒通膠囊治療組。HE染色和尼氏染色觀察大腦皮層區(qū)神經(jīng)元形態(tài)學(xué)變化；透射電鏡觀察神經(jīng)細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)改變；TUNEL法測定皮層區(qū)神經(jīng)細(xì)胞凋亡的表達(dá)；生化法檢測患側(cè)大腦組織中丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、乳酸(

7、LD)和乳酸脫氫酶(LDH)的活力和含量；ELISA法和放射免疫競爭法測定患側(cè)大腦組織和血清中IL-1β與TNF-α的含量；免疫組織化學(xué)法測定大腦皮層中MAP-2、β-tublin、Bax、Bcl-2、Fas、Fas-L與Caspase-3蛋白的表達(dá)；RT-PCR法測定大腦皮層內(nèi)Caspase-3基因的表達(dá)。 結(jié)果： (1) 腦缺血1.5h再灌注24h大鼠出現(xiàn)明顯的神經(jīng)功能缺損癥狀，腦組織有明顯的缺血形態(tài)學(xué)改變?nèi)缟窠?jīng)元水

8、腫、核固縮等現(xiàn)象。 (2) 心腦舒通膠囊可以升高缺血側(cè)大腦組織中SOD活力，降低MDA含量；降低LD含量和LDH活力。 (3) 心腦舒通膠囊可以減少血清TNF-α和IL-1β含量和缺血側(cè)大腦組織中TNF-α和IL-1β蛋白表達(dá)。 (4) 心腦舒通膠囊能夠增加缺血側(cè)大腦皮層內(nèi)MAP-2和β-tublin蛋白表達(dá)； (5) 心腦舒通膠囊明顯降低缺血側(cè)大腦皮層內(nèi)BaxN白表達(dá)，增加皮層內(nèi)Bcl-2蛋白表達(dá)和Bc

9、l-2/Bax比值；減少皮層內(nèi)Fas和Fas-L蛋白表達(dá)，降低皮層內(nèi)Caspase-3蛋白和基因表達(dá)，顯著減少凋亡的神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量。 第三部分：蒺藜皂苷對(duì)皮層神經(jīng)元凋亡的保護(hù)作用及機(jī)制研究 目的：從細(xì)胞內(nèi)鈣、線粒體膜電位、Caspase-3/7活性入手，觀察蒺藜皂苷對(duì)大鼠皮層神經(jīng)元經(jīng)缺氧/復(fù)氧后細(xì)胞凋亡的影響，并探討其可能的作用環(huán)節(jié)。 方法：原代培養(yǎng)大鼠皮層神經(jīng)元，先用95％N<,2>與5％CO<,2>混合氣體造成

10、細(xì)胞缺氧3小時(shí)，再給予95％O<,2>與5％CO<,2>混和氣進(jìn)行復(fù)氧，建立缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的皮層神經(jīng)元凋亡模型。中藥組于缺氧和復(fù)氧時(shí)分別加入不同濃度的蒺藜皂苷進(jìn)行干預(yù)。MTT法觀察蒺藜皂苷對(duì)皮層神經(jīng)元活力的影響，比色法測定細(xì)胞乳酸脫氫酶釋放漏出率；AO熒光染色和Annexin V-FITC*/PI雙染共同分析凋亡的神經(jīng)元形態(tài)和凋亡率；Fluo-3熒光染色，激光掃描共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞內(nèi)鈣平均熒光值變化；JC-1熒光染色，激光掃描共聚焦顯

11、微鏡觀察細(xì)胞線粒體膜電位的變化，熒光酶標(biāo)儀檢測神經(jīng)元胞漿Caspase-3/7的活性，并采用免疫細(xì)胞化學(xué)法觀察細(xì)胞Bax蛋白表達(dá)的情況。 結(jié)果：皮層神經(jīng)元經(jīng)缺氧3h復(fù)氧不同時(shí)間可造成細(xì)胞損傷，其中缺氧3h復(fù)氧12h誘導(dǎo)的神經(jīng)元損傷較為嚴(yán)重，以凋亡為主。蒺藜皂昔可增加皮層神經(jīng)元活力，降低乳酸脫氫酶漏出率和細(xì)胞內(nèi)鈣，增加細(xì)胞線粒體膜電位水平，抑制Caspase-3/7的活性，并降低Bax蛋白的表達(dá)，降低缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的皮層神經(jīng)元的凋

12、亡。 結(jié)論： 局灶性腦缺血后再灌注不同時(shí)間可以誘發(fā)不同程度的腦組織損傷和細(xì)胞凋亡，損傷部位以大腦皮層和尾殼核多見，皮層損傷范圍較廣，損傷的嚴(yán)重程度和細(xì)胞凋亡的表達(dá)多集中于再灌注24h，所以此時(shí)間點(diǎn)的腦缺血再灌注模型可以用來進(jìn)行藥物的干預(yù)研究。心腦舒通膠囊可以通過降低氧自由基損傷、炎性因子表達(dá)，維持細(xì)胞骨架的結(jié)構(gòu)完整性，減少細(xì)胞內(nèi)鈣超載，維持線粒體膜電位的穩(wěn)定，調(diào)節(jié)各種凋亡調(diào)控因子的表達(dá)，最終達(dá)到減少神經(jīng)細(xì)胞凋亡的發(fā)生，保

13、護(hù)受損的腦組織。我們認(rèn)為，腦缺血再灌注損傷的發(fā)生發(fā)展過程和終結(jié)果與中醫(yī)“內(nèi)毒損傷腦絡(luò)”的假說相符合，過多的氧自由基和代謝物質(zhì)、炎性因子和細(xì)胞內(nèi)鈣即相當(dāng)于“內(nèi)毒”，腦組織結(jié)構(gòu)損傷和神經(jīng)細(xì)胞凋亡即相當(dāng)于內(nèi)毒損傷腦絡(luò)的最終結(jié)果。內(nèi)毒損傷腦絡(luò)，其毒邪產(chǎn)生源于內(nèi)生諸邪，形成火毒、痰毒、瘀毒等，因此祛除內(nèi)生之毒，當(dāng)現(xiàn)解除生毒之邪，心腦舒通膠囊通過活血通絡(luò)，及時(shí)活血化瘀，可在一定程度上減緩腦梗死“瘀毒”的損害作用，全面地改善受損的腦組織，從而起到神經(jīng)