對(duì)比分析少陽(yáng)生骨方含藥血清對(duì)SD大鼠云分化軟骨細(xì)胞增殖及Ⅱ型膠原表達(dá)影響.pdf

1、目的:本課題以“少陽(yáng)主骨”為理論依據(jù)，“和解少陽(yáng)”為治則，擬定“少陽(yáng)生骨方”含藥血清干預(yù)體外去分化軟骨細(xì)胞。通過(guò)倒置顯微鏡觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況、CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活性及增殖情況、免疫組化法檢測(cè)Ⅱ型膠原表達(dá)情況，采用對(duì)比分析法，在細(xì)胞層面，探討“少陽(yáng)生骨方”對(duì)去分化軟骨細(xì)胞的作用，為中醫(yī)藥干預(yù)去分化軟骨細(xì)胞，維持細(xì)胞表型提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)以及理論參考，為該理論治療軟骨損傷提供可行性及可能機(jī)制，為下一步繼續(xù)研究“少陽(yáng)主骨”理論提供參考與借鑒。

2、>　　方法:
　　1.機(jī)械分離與酶聯(lián)合消化法對(duì)軟骨細(xì)胞體外分離、培養(yǎng)、鑒定。采用1周齡SD大鼠股骨髁透明軟骨為組織材料，用胰蛋白酶以及Ⅱ型膠原酶反復(fù)消化軟骨組織以獲取細(xì)胞懸液，將所收集的細(xì)胞懸液離心濃縮，然后按照一定細(xì)胞濃度將其置于含胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)。每日用倒置顯微鏡觀察并記錄細(xì)胞形態(tài)、包體大小以及細(xì)胞生長(zhǎng)情況。將所獲得的軟骨細(xì)胞用甲苯胺藍(lán)染色法和Ⅱ型膠原染色法進(jìn)行鑒定。
　　2.CCK-8法對(duì)去分化軟骨細(xì)胞進(jìn)

3、行細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期以及細(xì)胞凋亡研究將獲得的軟骨細(xì)胞置于含10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中連續(xù)培養(yǎng)到第五代成為去分化軟骨細(xì)胞，待細(xì)胞貼壁后，分別培養(yǎng)1D、2D、3D、4D、5D、6D、7D后，加入CCK-820ul。4小時(shí)后分別用酶標(biāo)儀檢測(cè)（檢測(cè)波長(zhǎng)為450nm）記錄其吸光度值。根據(jù)各孔吸光度值，繪制第五代軟骨細(xì)胞生長(zhǎng)濃度曲線圖。研究去分化軟骨細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期以及凋亡過(guò)程。
　　3.不同藥物含藥血清制備
　　根據(jù)體表面積法

4、計(jì)算出4周齡SD大鼠所需鹽酸氨基葡萄糖、少陽(yáng)生骨方的藥物劑量以及藥物濃度，根據(jù)等效劑量的藥物對(duì)SD大鼠進(jìn)行灌胃（空白對(duì)照組用等體積生理鹽水進(jìn)行灌胃處理），待藥物在動(dòng)物體內(nèi)達(dá)到穩(wěn)定藥物濃度后，于腹主動(dòng)脈進(jìn)行取血，將血液進(jìn)行離心以獲得含藥血清。
　　4.用不同藥物不同濃度含藥血清干預(yù)去分化軟骨細(xì)胞
　　待軟骨細(xì)胞傳至第五代成為去分化軟骨細(xì)胞，將去分化軟骨細(xì)胞進(jìn)行隨機(jī)分組并妥善編號(hào)，用預(yù)先提取的含有不同藥物的血清按不同濃度對(duì)去分化

5、軟骨細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)。每日在倒置顯微鏡下對(duì)細(xì)胞形態(tài)以及生長(zhǎng)情況進(jìn)行觀察并記錄。用CCK-8法測(cè)定不同藥物不同濃度血清干預(yù)軟骨細(xì)胞后的細(xì)胞增殖、生長(zhǎng)情況。用Ⅱ型膠原表達(dá)染色法測(cè)定不同藥物不同濃度血清干預(yù)去分化軟骨細(xì)胞后其Ⅱ型膠原陽(yáng)性表達(dá)率(％)。
　　結(jié)果:
　　1.采用機(jī)械分離與酶聯(lián)合消化方法建立SD大鼠軟骨細(xì)胞體外培養(yǎng)體系，經(jīng)倒置顯微鏡下形態(tài)學(xué)觀察、甲苯胺藍(lán)染色以及Ⅱ型膠原染色鑒定，確認(rèn)分離培養(yǎng)的細(xì)胞符合軟骨細(xì)胞特征。將其連續(xù)

6、傳代到第五代軟骨細(xì)胞，其生物學(xué)特征、形態(tài)學(xué)、組織化學(xué)染色顯示符合去分化軟骨細(xì)胞特征。
　　2.對(duì)去分化軟骨細(xì)胞進(jìn)行鏡下觀察提示:去分化軟骨細(xì)胞細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，呈梭形、三角形、多形性以及長(zhǎng)條形。細(xì)胞狀態(tài)活躍性喪失，細(xì)胞胞膜皺褶，胞核變小。對(duì)去分化軟骨細(xì)胞細(xì)胞周期觀察顯示:去分化軟骨細(xì)胞貼壁后會(huì)有1-2天的生長(zhǎng)恢復(fù)期，在這個(gè)時(shí)期，細(xì)胞狀態(tài)以及增殖能力都處于停滯狀態(tài)。在2-5天這個(gè)時(shí)期中，細(xì)胞會(huì)有一個(gè)高速的增殖期，該周期中細(xì)胞活力、細(xì)胞

7、狀態(tài)以及增殖能力都處于最佳狀態(tài)。從第5天開(kāi)始，細(xì)胞出現(xiàn)增殖速度降低、細(xì)胞形態(tài)和細(xì)胞活力降低甚至死亡。
　　3.不同濃度的藥物血清對(duì)第五代軟骨細(xì)胞干預(yù)結(jié)果顯示:含鹽酸氨基葡萄糖血清組和含少陽(yáng)生骨方血清組與空白對(duì)照組相比，含藥血清組細(xì)胞擁有胞漿較多，胞核較大，細(xì)胞表型維持較好等特點(diǎn)，但兩實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞形態(tài)、表型等均沒(méi)有明顯差異。用CCK-8法測(cè)定細(xì)胞增殖結(jié)果提示:含少陽(yáng)生骨方和鹽酸氨基葡萄糖血清組與空白對(duì)照組相比，在藥物干預(yù)48小時(shí)后其能

8、有效促進(jìn)去分化軟骨細(xì)胞的分裂增殖(P＜0.05)。但在藥物干預(yù)剛開(kāi)始24小時(shí)內(nèi)以及干預(yù)72小時(shí)后，含藥血清對(duì)去分化軟骨細(xì)胞分裂增殖影響不大(P＞0.05)。免疫組化法測(cè)定72小時(shí)候后Ⅱ型膠原染色表達(dá)陽(yáng)性率檢測(cè)結(jié)果提示:含少陽(yáng)生骨方和鹽酸氨基葡萄糖血清組與空白對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組Ⅱ型膠原表達(dá)陽(yáng)性率均好于空白對(duì)照組(P＜0.05)。但是少陽(yáng)生骨方組和鹽酸氨基葡萄糖組相比差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　結(jié)論:
　　不同濃度