龜鹿二仙膠及其拆方對大鼠軟骨細胞增殖與基質(zhì)合成的影響.pdf

1、目的:
　　 應用體外軟骨細胞培養(yǎng)技術(shù),建立軟骨細胞培養(yǎng)體系。按單味藥研究方法將龜鹿二仙膠拆分為龜板、鹿角、人參和枸杞四味拆方,對比觀察龜鹿二仙膠全方及四味拆方對大鼠關(guān)節(jié)軟骨細胞的作用,通過對其促進軟骨細胞增殖、Ⅱ型膠原以及蛋白黏多糖合成影響的觀察,從細胞、分子水平探討龜鹿二仙膠及其拆方對軟骨細胞的作用機制,闡述龜鹿二仙膠方君臣配伍關(guān)系的科學內(nèi)涵,為開發(fā)高效優(yōu)質(zhì)的中藥新藥提供科學依據(jù)。
　　 方法:
　　 1.建

2、立軟骨細胞體外培養(yǎng)體系:采用酶消化方法分離原代軟骨細胞;倒置顯微鏡下觀察各代軟骨細胞的形態(tài)學變化;MTT法描繪各代軟骨細胞生長曲線,觀察細胞生長特性;甲苯胺藍染色結(jié)合Ⅱ型膠原免疫細胞化學染色聯(lián)合鑒定軟骨細胞表型。
　　 2.MTT比色法檢測龜鹿二仙膠及其拆方含藥血清對軟骨細胞增殖的影響,并探討龜鹿二仙膠及其拆方含藥血清在不同灌胃劑量以及不同干預時間下對軟骨細胞增殖影響,篩選出各藥物劑量組含藥血清促進軟骨細胞增殖的最佳量效以及最佳

3、時效。
　　 3.免疫細胞化學法檢測龜鹿二仙膠及其拆方含藥血清對軟骨細胞Ⅱ型膠原表達的影響。
　　 4.高碘酸希爾(PAS)染色法檢測龜鹿二仙膠及其拆方含藥血清對軟骨細胞中性黏多糖表達的影響。
　　 5.阿爾辛藍(AB)染色法檢測龜鹿二仙膠及其拆方對軟骨細胞酸性黏多糖表達的影響。
　　 6.PAS-AB法聯(lián)合染色檢測龜鹿二仙膠及其拆方對軟骨細胞蛋白黏多糖表達的影響。
　　 結(jié)果:
　　 1

4、.成功分離并培養(yǎng)4周齡SD大鼠關(guān)節(jié)軟骨細胞;原代培養(yǎng)的軟骨細胞48h后外觀呈星狀形、不規(guī)則形,胞漿豐富,核仁清晰。組織形態(tài)學、甲苯胺藍染色和免疫細胞化學染色以及MTT描繪生長曲線結(jié)果顯示,軟骨細胞培養(yǎng)3代以內(nèi)可以良好維持表型的穩(wěn)定,傳4代以后開始出現(xiàn)去分化現(xiàn)象。
　　 2.MTT比色法篩選結(jié)果顯示:各藥物組在24h、48h、72h對軟骨細胞的增殖效應均不隨劑量呈比例遞增趨勢,其中以中劑量藥物組干預軟骨細胞48h促增殖藥效最佳,選

5、取作為促進軟骨細胞增殖的最佳量效以及最佳時效并作為后續(xù)試驗干預方案;48h時,OTL(OTL)組和全方組均可非常顯著促進軟骨細胞增殖(P＜0.01),鹿角組和龜板組均可顯著促進軟骨細胞增殖(P＜0.05),人參組和枸杞組對軟骨細胞增殖作用無統(tǒng)計學差異(P＞0.05);與全方組比較,OTL組有顯著差異(P＜0.05);鹿角組或龜板組均具有顯著差異(P＜0.05),人參組或枸杞組均具有非常顯著差異(P＜0.01);各拆方組比較,鹿角組或龜板

6、組與人參組或枸杞組比較均具有顯著差異(P＜0.05),鹿角組與龜板組比較、人參組與枸杞組比較均無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)。
　　 3.免疫細胞化學結(jié)果顯示:各組標本均可見Ⅱ型膠原表達,表達部位為胞漿,可見棕黃色顆?；虺蓤F片狀。OTL組與全方組均可非常顯著促進軟骨細胞Ⅱ型膠原表達(P＜0.01);鹿角組或龜板組均可顯著促進軟骨細胞Ⅱ型膠原表達(P＜0.05);人參組或枸杞組對促進軟骨細胞Ⅱ型膠原表達無統(tǒng)計學差異(P＞0.05);

7、與全方組比較,OTL組有顯著差異(P＜0.05);鹿角組或龜板組均呈顯著差異(P＜0.05),人參組或枸杞組均呈非常顯著差異(P＜0.01);各拆方組比較,鹿角組或龜板組與人參組或枸杞組比較有顯著差異(P＜0.05),鹿角組與龜板組比較、人參組與枸杞組比較均無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)。
　　 4.PAS法染色結(jié)果顯示:各組標本均可見中性黏多糖表達,表達部位為軟骨基質(zhì)與細胞周圍,可見紫紅色顆?；虺蓤F片狀,OTL組與全方組均可非常

8、顯著促進軟骨細胞中性黏多糖表達(P＜0.01);鹿角組或龜板組均可顯著促進軟骨細胞中性黏多糖的表達(P＜0.05);人參組或枸杞組對促進軟骨細胞中性黏多糖的表達無統(tǒng)計學差異(P＞0.05):與全方組比較,OTL組具有顯著差異(P＜0.05);鹿角組或龜板組均呈顯著差異(P＜0.05),人參組或枸杞組均呈非常顯著差異(P＜0.01);各拆方組比較,鹿角組或龜板組與人參組或枸杞組比較有顯著差異(P＜0.05),鹿角組與龜板組比較、人參組與枸

9、杞組比較均無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)。
　　 5.AB法染色結(jié)果顯示:各組標本均可見酸性黏多糖表達,表達部位為細胞核與胞核周圍,可見胞核呈深藍色異染,胞核周圍呈淡藍色異染,OTL組與全方組均可非常顯著促進軟骨細胞酸性黏多糖表達(P＜0.01);鹿角組或龜板組均可顯著促進軟骨細胞酸性黏多糖的表達(P＜0.05);人參組或枸杞組對促進軟骨細胞酸性黏多糖的表達無統(tǒng)計學差異(P＞0.05);與全方組比較,OTL組呈顯著差異(P＜0.0

10、5);鹿角組或龜板組均呈顯著差異(P＜0.05),人參組或枸杞組均呈非常顯著差異(P＜0.01);各拆方組比較,鹿角組或龜板組與人參組或枸杞組比較有顯著差異(P＜0.05),鹿角組與龜板組比較、人參組與枸杞組比較均無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)。
　　 結(jié)論:
　　 采用酶消化法分離培養(yǎng)的大鼠軟骨細胞,在3代以內(nèi)可良好維持細胞表型,符合軟骨細胞生物學特性;龜鹿二仙膠及其拆方含藥血清對軟骨細胞的增殖均不隨劑量以及干預時間呈比

11、例遞增趨勢,以中劑量含藥血清干預48h時促進軟骨細胞增殖藥效最佳;龜鹿二仙膠可非常顯著促進軟骨細胞增殖以及Ⅱ型膠原和蛋白黏多糖的合成,全方藥效顯著優(yōu)于各拆方,與陽性對照組藥物OTL具有類似藥效;拆方龜板、鹿角均可有效促進軟骨細胞增殖以及Ⅱ型膠原和蛋白黏多糖的合成;人參、枸杞對軟骨細胞增殖以及Ⅱ型膠原和蛋白黏多糖的合成均無明顯促進作用;說明龜板、鹿角是全方中發(fā)揮主要作用的藥物,顯示出了君藥的重要地位;提示龜板和鹿角均可能含有某類可直接刺激