固本化痰通脈方含藥血清對大鼠VSMC的增殖及粘附分子表達(dá)的影響.pdf

1、動脈粥樣硬化(Atherosclerosis，AS)、冠心病是心血管系統(tǒng)中最常見的疾病之一，對其發(fā)病機(jī)制目前尚未完全闡明。動物實(shí)驗(yàn)證實(shí)，血管平滑肌細(xì)胞(VascularSmoothMuscleCell,VSMC)的異常增殖是AS形成的關(guān)鍵。AS斑塊形成涉及脂類代謝障礙、血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷、巨噬細(xì)胞浸潤、VSMC增殖和血小板聚集等多種因素。其中VSMC異常增殖在AS斑塊形成中發(fā)揮重要作用。近年來，人們在研究VSMC異常增殖與AS發(fā)生的關(guān)系時

2、，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞死亡存在于AS發(fā)生發(fā)展的各個階段，因而推論VSMC異常增殖是由于細(xì)胞死亡和增殖平衡失調(diào)的結(jié)果。 體內(nèi)的腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)是主要的體液調(diào)節(jié)系統(tǒng)，其中血管緊張素Ⅱ(AngiotensinⅡ，AngⅡ)與VSMC增殖的關(guān)系一直備受關(guān)注。上述因子可最終導(dǎo)致血管內(nèi)膜異常增生和管腔狹窄。研究表明，AngⅡ具有促生長激素樣作用，可刺激心肌細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、VSMC的DNA和蛋白質(zhì)合成增加。離體發(fā)現(xiàn)，AngⅡ作用早期促細(xì)胞分

3、裂效應(yīng)較弱，但后期DNA合成明顯增加，細(xì)胞數(shù)增多，而且對正常結(jié)構(gòu)血管的VSMC亦有促有絲分裂作用。體內(nèi)研究發(fā)現(xiàn)大鼠頸動脈內(nèi)皮損傷后輸注AngⅡ可使新生內(nèi)膜增生加重。AngⅡ的異常分泌與VSMC增生、增殖相關(guān)，如何拮抗這一作用，抑制VSMC的異常增殖，具有重要治療價值。 近10余年來，隨著分子生物學(xué)及免疫學(xué)等相關(guān)基礎(chǔ)學(xué)科的迅速發(fā)展，炎癥在冠心病發(fā)病機(jī)制中的作用日益受到重視。在炎癥過程中，白細(xì)胞與血管內(nèi)皮之間的粘附是炎癥的起始步驟，

4、這一過程由炎癥細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞表面的細(xì)胞粘附分子所介導(dǎo)；另外，在細(xì)胞粘附分子的介導(dǎo)下，炎癥細(xì)胞沿血管內(nèi)皮細(xì)胞滾動粘附，滲透到內(nèi)皮細(xì)胞下，并分泌釋放各種細(xì)胞活性物質(zhì)，引起血管平滑肌細(xì)胞增生、泡沫細(xì)胞形成，最終導(dǎo)致動脈粥樣硬化斑塊的形成。細(xì)胞粘附分子在上述炎癥反應(yīng)各階段均起重要作用。因此，對細(xì)胞粘附分子的研究必將為冠心病的診斷、治療和預(yù)防開辟新的前景。 現(xiàn)有的研究成果證實(shí)，中醫(yī)藥在治療高脂血癥和AS方面有肯定的療效。中醫(yī)學(xué)以整體觀

5、念和辨證論治為特點(diǎn)，以療效確切、毒副作用小的優(yōu)勢，為廣大醫(yī)家所認(rèn)可，也積累了豐富的經(jīng)驗(yàn)。從AS虛實(shí)夾雜的病機(jī)特點(diǎn)出發(fā)，結(jié)合臨床實(shí)踐和實(shí)驗(yàn)研究，我們認(rèn)為脾腎二臟虧虛是AS發(fā)生的病理基礎(chǔ)，痰濁內(nèi)停是AS發(fā)生的病理關(guān)鍵。在發(fā)病過程中，脾腎虧虛與痰濁兩者又互相影響，互為因果。所以，本病的治療宜補(bǔ)腎健脾以治本，化痰降濁以治標(biāo)。 本實(shí)驗(yàn)我們采用了體外培養(yǎng)大鼠主動脈VSMC的方法，研究了在AngⅡ刺激下VSMC的增生、增殖規(guī)律和對VSMC粘附

6、分子的表達(dá)，并探討了固本化痰通脈方含藥血清(GBHTTMP)對VSMC的增殖及粘附分子表達(dá)的影響。從而從細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)水平探討GBHTTMP抗AS的理論依據(jù)及作用機(jī)制。 目的研究在血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)刺激下VSMC的增殖規(guī)律和粘附分子的表達(dá)，并觀察GBHTTMP對大鼠VSMC增殖以及粘附分子表達(dá)的影響，揭示該方抗AS的作用機(jī)理。 方法選用健康雄性Wistar大鼠，取其胸主動脈，分離外膜和內(nèi)膜后，取其中膜進(jìn)行原

7、代培養(yǎng)，VSMC的培養(yǎng)采用常規(guī)貼塊細(xì)胞培養(yǎng)方法進(jìn)行。傳至四代后，用抗a-actin的免疫組織化學(xué)染色鑒定細(xì)胞。并用AngⅡ刺激細(xì)胞24h后進(jìn)行分組.實(shí)驗(yàn)分為4組：正常組、AngⅡ刺激組、固本化痰通脈方含藥血清高劑量組(簡稱固高組)、低劑量組(簡稱固低組)。鏡下觀察細(xì)胞生長狀況，應(yīng)用四甲基偶氮唑藍(lán)還原反應(yīng)(MTT法)、細(xì)胞計(jì)數(shù)、流式細(xì)胞技術(shù)和免疫組化檢測VSMC增殖及VCAM-1的表面表達(dá)及蛋白的表達(dá)。 結(jié)果1.AngⅡ可明顯刺激

8、VSMC增殖。在一定濃度范圍內(nèi)，呈劑量依賴性。其中以AngⅡ?yàn)?0-6mol/L時最顯著。2.加入GBHTTMP含藥血清干預(yù)因素后，均抑制AngⅡ在各個作用時間的促VSMC增殖作用。與AngⅡ組比較，GBHTTMP大劑量和小劑量含藥血清可使MTTOD吸光度值下降，有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；并能顯著抑制VSMC由靜止期向合成期轉(zhuǎn)變，使VSMC停滯在G0/G1期。AngⅡ促使細(xì)胞周期由G0/G1期向S/G2-M期轉(zhuǎn)變。10-6mol/LAngⅡ刺

9、激后，細(xì)胞逐漸進(jìn)入分裂期，而加入小劑量的GBHTTMP含藥血清后，VSMC細(xì)胞周期分布發(fā)生變化，G0/G1期細(xì)胞比例增加，而合成增殖的S期細(xì)胞比例減少，出現(xiàn)G0/G1期細(xì)胞周期阻滯作用。3.流式細(xì)胞術(shù)和免疫組化結(jié)果所示，AngⅡ可使VSMC表面VCAM-1表達(dá)明顯增加，與正常組比較有顯著性差異。GBHTTMP可明顯抑制AngⅡ誘導(dǎo)的VSMC表達(dá)VCAM-1，與模型組有顯著性差異。 結(jié)論1.AngⅡ能促進(jìn)VSMC的增殖，GBHTT