Hippo通路主要組分與小鼠原始卵泡池大小的時序相關(guān)性研究.pdf

1、背景及目的:
　　闡明原始卵泡啟動的分子機(jī)制對于防治女性不孕癥和卵巢早衰具有重要意義。最近研究表明,卵巢皮層密度變化能觸發(fā)原始卵泡的啟動,而在果蠅中的研究顯示由多個癌基因(Mst/Lats/Yap)參與的Hippo信號通路可感知卵巢細(xì)胞密度的變化。本課題探究Hippo通路主要組份MST、LATS、YAP與小鼠原始卵泡池大小的時序相關(guān)性以及原始卵泡啟動前后的表達(dá)變化,為進(jìn)一步了解卵巢的功能及其調(diào)控機(jī)理增添新資料。
　　方法:<

2、br>　　1.利用Western blot、Real-time PCR及免疫組化等方法檢測出生后3d、1m、5m及16m等不同月齡小鼠卵巢中mst、lats和yap mRNA及蛋白的表達(dá)變化及定位,分析Hippo信號通路主要組分與原始卵泡池大小的時序相關(guān)性。
　　2.建立小鼠原始卵泡體外培養(yǎng)模型,利用Western blot、Real-time PCR及免疫組化等方法檢測mst、lats和yap mRNA及蛋白在原始卵泡啟動前后表

3、達(dá)變化。
　　3.利用Western blot檢測原始卵泡啟動前后及卵泡發(fā)育過程中P-YAP蛋白表達(dá)變化,分析P-YAP/YAP比值變化情況。
　　結(jié)果:
　　1.Western blot結(jié)果顯示:MST蛋白以3d組含量最高,此后隨著月齡的增長,MST含量顯著減少(p<0.05),但1m、5m、16m三組之間表達(dá)并無顯著性差異(p>0.05);LATS蛋白表達(dá)亦呈現(xiàn)與MST的變化趨勢(p<0.05,p<0.01,p<0

4、.05),但16m與5m相比較卻顯著增多(p<0.05);YAP蛋白表達(dá)以3d組最低,此后1m、5m、16m組顯著升高(p<0.05,p<0.01,p<0.01),而16m與5m組比較顯著減少(p<0.05)。P-YAP蛋白表達(dá)與3d組相比,1m、5m、16m均顯著增多(p<0.05),但1m、5m、16m三組之間表達(dá)無顯著性差異(p>0.05);隨著月齡增加,P-YAP/YAP比值均顯著減少(p<0.05),但16m與5m組比較無顯著

5、性差異(p>0.05)。
　　2. Real-time PCR結(jié)果顯示:隨著小鼠月齡的增長,mst、lats mRNA表達(dá)均表現(xiàn)為3d最多,此后逐漸減少(p<0.05,p<0.01,p<0.01),然而16m組表達(dá)顯著高于5m組(p<0.05);yap mRNA表達(dá)3d最少,此后極為顯著增多,(p<0.01, p<0.001,p<0.01),但16m組表達(dá)顯著低于5m組(p<0.05)。
　　3.免疫組化結(jié)果顯示:MST、L

6、ATS、YAP在原始卵泡中均主要分布于卵母細(xì)胞質(zhì)中,在初級卵泡、次級卵泡和成熟卵泡的卵母細(xì)胞質(zhì)、卵周膜及顆粒細(xì)胞中均有表達(dá),且在次級卵泡中強(qiáng)表達(dá)于顆粒細(xì)胞,在閉鎖卵泡中則少表達(dá)或無表達(dá)。此外,P-YAP亦表達(dá)于卵巢卵泡中,在原始卵泡的卵母細(xì)胞質(zhì)中有表達(dá),在初級卵泡、次級卵泡及成熟卵泡中主要分布于卵母細(xì)胞質(zhì)、卵周膜和顆粒細(xì)胞,在閉鎖卵泡中主要分布于顆粒細(xì)胞中。
　　4.3日齡小鼠卵巢體外培養(yǎng)8天后,HE染色結(jié)果顯示原始卵泡大量啟動發(fā)

7、育為初級卵泡,Western blot及免疫組化結(jié)果均顯示PCNA蛋白表達(dá)顯著增加(p<0.05),提示小鼠原始卵泡Waymouth體外培養(yǎng)體系成功建立。
　　5.利用Western blot及Real-time PCR檢測原始卵泡啟動前后MST、LATS、YAP表達(dá)量變化,結(jié)果顯示:mst mRNA及蛋白表達(dá)均顯著減少(p<0.05);lats mRNA及蛋白表達(dá)均顯著減少(p<0.05);yap mRNA及蛋白表達(dá)均顯著增多(