Lnc-11的鑒定及其在肝癌中的表達(dá)及功能研究.pdf

1、目的:
　　肝癌的發(fā)生和發(fā)展是一個(gè)多因素參與的復(fù)雜的調(diào)控過(guò)程。從一定意義上來(lái)說(shuō)，其發(fā)生是正常細(xì)胞內(nèi)的重要調(diào)控基因失常的導(dǎo)致的最終結(jié)果。從分子水平找出肝癌特異性腫瘤標(biāo)志物，為檢測(cè)肝癌的發(fā)生發(fā)展和預(yù)后，針對(duì)性的進(jìn)行靶向治療具有重要的臨床應(yīng)用價(jià)值。
　　長(zhǎng)鏈非編碼RNAs(LncRNAs)一般是指大于200個(gè)核苷酸(nucleotide，nt)的非編碼RNA。近年來(lái)的研究表明，它們?cè)谂咛グl(fā)育和細(xì)胞分化中都起著重要作用，具有極其復(fù)雜

2、而重要的生物學(xué)功能。越來(lái)越多的研究結(jié)果顯示LncRNA在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮了重要的作用，但相對(duì)于編碼基因，非編碼RNA在腫瘤中的研究還處于起步階段。尋找到腫瘤特異的長(zhǎng)非編碼RNA，揭示它在腫瘤中的功能對(duì)闡明腫瘤的發(fā)病機(jī)制，發(fā)現(xiàn)潛在的診斷和治療靶點(diǎn)很有意義。
　　方法:
　　本研究分為四個(gè)部分:
　　1.驗(yàn)證Lnc-11在肝癌組織標(biāo)本中表達(dá)水平:通過(guò)QRT-PCR技術(shù)檢測(cè)Lnc-11在肝癌組織與正常肝組織中的表達(dá)水平，

3、對(duì)前期實(shí)驗(yàn)用芯片檢測(cè)出的Lnc-11在腫瘤中的表達(dá)水平進(jìn)行驗(yàn)證。
　　2.Lnc-11起止序列的鑒定:通過(guò)RACE技術(shù)擴(kuò)增出Lnc-11的5'端和3'端序列，并將RACE產(chǎn)物與pGEM(@)-T Easy載體的連接，EcoR1酶切鑒定陽(yáng)性克隆，然后進(jìn)行基因測(cè)序鑒定，最后比對(duì)數(shù)據(jù)庫(kù)中的序列確定Lnc-11的起止系列。
　　3.Lnc-11過(guò)表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建:依據(jù)RACE技術(shù)鑒定出Lnc-11的5'端和3'端序列，設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增Ln

4、c-11的全長(zhǎng)序列，并引入用BamHⅠ和XholⅠ酶切位點(diǎn)，對(duì)Lnc-11的PCR產(chǎn)物和pcDNATM3.1(+)和pcDNATM3.1(-)質(zhì)粒雙酶切后分別進(jìn)行連接，構(gòu)建pcDNATM3.1(+)-Lnc11和pcDNArM3.1(-)-Lnc11重組質(zhì)粒，測(cè)序鑒定。
　　4.Lnc-11對(duì)肝癌細(xì)胞的遷徙和增殖能力的影響:通過(guò)轉(zhuǎn)染Lnc-11的重組質(zhì)粒，上調(diào)肝癌細(xì)胞中Lnc-11的表達(dá)水平，并通過(guò)QRT-PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞過(guò)表達(dá)

5、的效率;進(jìn)一步通過(guò)劃痕修復(fù)、Transwell遷移實(shí)驗(yàn)和增殖實(shí)驗(yàn)，揭示Lnc-11的功能。
　　結(jié)果:
　　1.通過(guò)QRT-PCR技術(shù)對(duì)43對(duì)肝癌組織及相應(yīng)的癌旁組織中Lnc-11的表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，相對(duì)于正常肝組織Lnc-11在肝癌組織中表達(dá)水平顯著下調(diào)，與芯片結(jié)果相符。
　　2.通過(guò)RACE技術(shù)擴(kuò)增出Lnc-11的5'端和3'端序列，經(jīng)過(guò)瓊脂糖凝膠電泳鑒定，分別得到約500bp和400bp大小的片段。經(jīng)過(guò)

6、膠回收、連接pGEM(@)-T Easy載體，酶切鑒定，陽(yáng)性克隆送基因公司測(cè)序。測(cè)序結(jié)果顯示5'端序列與數(shù)據(jù)庫(kù)中注釋的序列一致，3'序列較數(shù)據(jù)庫(kù)中注釋的序列少約100bp。
　　3.依據(jù)RACE技術(shù)鑒定出Lnc-11的5'端和3'端序列，設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增Lnc-11的全長(zhǎng)序列，得到約1700bp的片段，連接于pcDNATM3.1(+)和pcDNATM3.1（-）質(zhì)粒，構(gòu)建pcDNATM3.1(+)-Lnc11和pcDNATM3.1(-

7、)-Lnc11重組質(zhì)粒經(jīng)酶切鑒定后經(jīng)DNA測(cè)序證實(shí)其序列以及插入方向正確。
　　4.在肝癌細(xì)胞中轉(zhuǎn)染Lnc-11的重組質(zhì)粒，QRT-PCR驗(yàn)證Lnc-11的表達(dá)水平上調(diào)約300倍;轉(zhuǎn)染24小時(shí)候進(jìn)行功能實(shí)驗(yàn)，劃痕實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染Lnc-11的重組質(zhì)粒的細(xì)胞，較轉(zhuǎn)染空載體的細(xì)胞和轉(zhuǎn)染Lnc-11反義序列的重組質(zhì)粒的細(xì)胞爬行的能力顯著將降低;Traswell遷移實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染Lnc-11的重組質(zhì)粒的細(xì)胞較兩組對(duì)照細(xì)胞遷移的能

8、力顯著下降;而增殖實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示，Lnc11對(duì)肝癌細(xì)胞的增殖能力無(wú)顯著影響。
　　結(jié)論:
　　與正常肝組織相比Lnc-11在肝癌組織標(biāo)本中表達(dá)量顯著下調(diào)，與前期非編碼RNA芯片所得結(jié)果相符;并通過(guò)RACE技術(shù)鑒定出Lnc-11的5'和3'序列，并成功擴(kuò)增出Lnc-11的全長(zhǎng)序列，并構(gòu)建pcDNATM3.1(+)-Lnc11和pcDNATM3.1(-)-Lnc11重組質(zhì)粒;通過(guò)轉(zhuǎn)染Lnc-11的重組質(zhì)粒，上調(diào)肝癌細(xì)胞中Lnc-