紫芪方對(duì)腸道屏障功能保護(hù)作用的實(shí)驗(yàn)研究及機(jī)制探討.pdf

1、背景：腸道是機(jī)體遭受創(chuàng)傷后最早發(fā)生病理生理變化的器官。Wilmore稱(chēng)腸道為“外科應(yīng)激條件下的中心器官”；Meakins稱(chēng)之為“MOF”的動(dòng)力器官。腸道因其在體內(nèi)獨(dú)特的生理環(huán)境及特殊的生理構(gòu)造而參與了幾乎所有危重病的病理生理過(guò)程。腸道是肌體除體表以外隔絕外環(huán)境的主要屏障，又是體內(nèi)最大的細(xì)菌儲(chǔ)源，腸道細(xì)菌或內(nèi)毒素易位進(jìn)入淋巴或直接引流入肝而成為炎癥反應(yīng)的啟動(dòng)者。因此在MODS的發(fā)生中，腸道既是受損的“靶”器官，又是損傷的“激發(fā)”器官。

2、 近年來(lái)在“腸道靶學(xué)說(shuō)”牽引下開(kāi)展了大量化學(xué)、生化藥物防止內(nèi)毒素移位、保護(hù)腸粘膜屏障功能等方面的藥物研究，但仍存在諸如療效、副作用、價(jià)格昂貴等不利因素，限制了臨床使用。近年研究表明，中藥制品不僅在毒副作用、環(huán)境污染等方面有化學(xué)、生物藥品無(wú)法比擬的優(yōu)勢(shì)，同時(shí)對(duì)機(jī)體遭受?chē)?yán)重外來(lái)?yè)p傷時(shí)腸道損傷的保護(hù)具有多靶位效應(yīng)，諸如，改善微循環(huán)、清除自由基及抑制細(xì)胞凋亡等保護(hù)效應(yīng)。由于目前開(kāi)展的研究局限于中藥單方、單一成分或少數(shù)傳統(tǒng)方劑注射劑對(duì)腸道的保

3、護(hù)研究，對(duì)于新的復(fù)方藥物的研究缺少足夠的重視，沒(méi)有充分體現(xiàn)傳統(tǒng)中醫(yī)藥整體施治疾病的醫(yī)療思想。因此，以加強(qiáng)內(nèi)源性抗損傷的醫(yī)療思想為指導(dǎo)，在中醫(yī)傳統(tǒng)方劑及現(xiàn)代中藥研究成果基礎(chǔ)上開(kāi)展中藥復(fù)方保護(hù)腸道屏障功能的基礎(chǔ)研究，無(wú)疑對(duì)研制開(kāi)發(fā)復(fù)方制劑研究的模式及臨床使用具有重要的意義。 目的：構(gòu)建保護(hù)腸道屏障功能的復(fù)方中藥-紫芪方；探討紫芪方對(duì)腸上皮細(xì)胞(IEC-6)缺氧再?gòu)?fù)氧損傷的保護(hù)效應(yīng)；闡述紫芪方對(duì)失血性休克腸道屏障功能的保護(hù)作用及其機(jī)制

4、，為中藥復(fù)方制劑保護(hù)腸道屏障的研究構(gòu)建技術(shù)平臺(tái)及提供理論依據(jù)。 方法： 一、應(yīng)用大鼠小腸上皮細(xì)胞(IEC-6)體外缺氧再?gòu)?fù)氧損傷模型，觀察不同濃度參附方血清對(duì)細(xì)胞LDH釋放的影響，建立藥物血清的制備和血清藥理學(xué)研究技術(shù)；采用均勻設(shè)計(jì)法，設(shè)計(jì)組分不同用量配比的中藥復(fù)方，觀察不同設(shè)計(jì)方案配比的中藥復(fù)方對(duì)缺氧再?gòu)?fù)氧損傷細(xì)胞LDH釋放量的影響，從而獲取最佳組分配比的中藥復(fù)方-紫芪方。 二、采用上述血清藥理學(xué)技術(shù)，以參附湯

5、作為陽(yáng)性對(duì)照藥物，觀察紫芪方及參附方藥物血清對(duì)缺氧再?gòu)?fù)氧損傷IEC-6小腸上皮細(xì)胞LDH釋放量、細(xì)胞活力、細(xì)胞凋亡率、脂質(zhì)過(guò)氧化、能量代謝、細(xì)胞內(nèi)游離鈣濃度、線粒體膜電位及Bcl-2抗凋亡基因及目的蛋白表達(dá)的影響，探討紫芪方對(duì)腸上皮細(xì)胞缺氧再?gòu)?fù)氧損傷的保護(hù)效應(yīng)。 三、實(shí)驗(yàn)采用Wistar實(shí)驗(yàn)大鼠，按照改良Wiggers法復(fù)制失血性休克模型，實(shí)驗(yàn)分為正常對(duì)照組、失血性休克組、紫芪方治療組、參附治療組、蒸餾水對(duì)照組，除正常和休克對(duì)照

6、組外，其余各組均給予二倍失血量液體復(fù)蘇后分別經(jīng)口服給予不同干預(yù)藥物。觀察了實(shí)驗(yàn)藥物治療后對(duì)失血性休克大鼠活存率、血壓、器官血流量、頸動(dòng)脈A血流量、腸道蠕動(dòng)速率、體內(nèi)外抑菌、血漿內(nèi)毒素、細(xì)菌移位、腸組織DAO和D-乳酸含量、線粒體呼吸功能、線粒體膜電位、Na+-K+ATP酶的活性、組織內(nèi)MDA含量和SOD活性、細(xì)胞色素C活性、Bcl-2基因表達(dá)及COXⅠ、Ⅱ、Ⅲ基因的表達(dá)。 結(jié)果： 一、通過(guò)細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察及缺氧再?gòu)?fù)氧后細(xì)胞

7、培養(yǎng)上清液中LDH的變化，確定了缺氧90min再?gòu)?fù)氧60min處理后的IEC-6小腸上皮細(xì)胞的損傷模型。 二、通過(guò)觀察實(shí)驗(yàn)大鼠灌服不同劑量和不同給藥次數(shù)的參附藥液而制備的藥物血清對(duì)缺氧再?gòu)?fù)氧損傷IEC-6細(xì)胞LDH漏出量的影響，確定了采取間隔1h兩次給予大劑量(11.25g/kg)參附藥液1h后，經(jīng)頸動(dòng)脈無(wú)菌條件下采集血漿及制各藥物血清的方法；建立中藥復(fù)方對(duì)缺氧再?gòu)?fù)氧細(xì)胞損傷保護(hù)作用的血清藥理學(xué)研究方法；并經(jīng)過(guò)對(duì)不同配比方案制備

8、的中藥復(fù)方及其不同組分藥材的藥物血清對(duì)損傷細(xì)胞LDH釋放量影響的血清藥理學(xué)研究結(jié)果，優(yōu)化了中藥復(fù)方組分配比方案，確定了紫芪方組分配比。 三、與缺氧再?gòu)?fù)氧組比較，紫芪方和參附血清治療組能夠降低缺氧再?gòu)?fù)氧IEC-6細(xì)胞損傷程度，主要表現(xiàn)以下幾個(gè)方面：(1)減少細(xì)胞培養(yǎng)液上清LDH釋放量；(2)提高細(xì)胞生長(zhǎng)活力；(3)抑制細(xì)胞異常凋亡；(4)提高細(xì)胞抗自由基損傷的能力；(5)線粒體膜電位顯著增高，腸上皮細(xì)胞內(nèi)ATP含量及能荷顯著升高；

9、(6)降低細(xì)胞鈣離子超載損傷程度。 四、采用RT-PCR及WesternBlot方法，檢測(cè)了紫芪方和參附血清治療后，缺氧再?gòu)?fù)氧損傷IEC-6細(xì)胞Bcl-2基因及其目的蛋白的表達(dá)，結(jié)果顯示，紫芪方能夠顯著提高Bcl-2的基因及其目的蛋白的表達(dá)。 五、與失血性休克對(duì)照組比較，紫芪方能夠顯著提高失血性休克10小時(shí)大鼠活存率；休克5h，紫芪方組血壓顯著高于液體復(fù)蘇組(P＜0.05)，9h后差異非常顯著(P＜0.01)，呼吸呈現(xiàn)同

10、樣趨勢(shì)。單純復(fù)蘇對(duì)照組大鼠平均存活時(shí)間是9.84h；紫芪方組是13.8h，參附組是12.56h，顯著優(yōu)于與單純復(fù)蘇對(duì)照組(P＜0.05)。 六、紫芪方及參附治療均可改善休克大鼠的腸道屏障功能，與休克對(duì)照組比較：(1)能夠顯著改善休克大鼠腸黏膜微循環(huán)血流量；(2)提高正常和休克狀態(tài)實(shí)驗(yàn)大鼠腸道蠕動(dòng)速率；(3)顯著降低血漿中D-乳酸、DAO及內(nèi)毒素水平；(4)降低大鼠腸粘膜組織MDA含量并提高SOD活性，減輕組織脂質(zhì)過(guò)氧化損傷；(5

11、)改善休克大鼠腸上皮細(xì)胞線粒體功能，紫芪方能治療組提高休克腸上皮細(xì)胞線粒體膜電位水平，改善線粒體呼吸功能，提高組織Na+-K+ATP酶及細(xì)胞色素C氧化酶的活性；(6)提高腸道免疫功能，紫芪方顯著提高休克大鼠腸道內(nèi)容物、血漿中IgA的含量，并且提高CD3、CD4細(xì)胞數(shù)量和CD4/CD8的比值。 七、采用RT-PCR及WesternBlot方法，檢測(cè)不同組別細(xì)胞Bcl-2、線粒體COX基因及目的蛋白的表達(dá)，與休克和蒸餾水對(duì)照組比較，

12、紫芪方治療組提高了Bcl-2、COXⅠ、及COXⅡ的表達(dá)。 討論： 紫芪方是一中藥復(fù)方，內(nèi)含多種藥物成分，對(duì)腸道屏障功能損傷具有多靶位保護(hù)效應(yīng)，其保護(hù)作用的機(jī)制可能主要包括以下幾個(gè)方面： 一、紫芪方能夠抑制脂質(zhì)過(guò)氧化對(duì)線粒體的損傷：線粒體既是氧自由基產(chǎn)生的重要場(chǎng)所，又是氧化損傷的主要靶細(xì)胞器；同時(shí)mtDNA定位于線粒體基質(zhì)，不與組蛋白結(jié)合，“裸露”于線粒體所產(chǎn)生的自由基周?chē)?，?duì)自由基攻擊十分敏感，可導(dǎo)致mtDNA

13、堿基缺失或環(huán)狀結(jié)構(gòu)破壞，影響其正常轉(zhuǎn)錄，可能與細(xì)胞延遲死亡有關(guān)。紫芪方通過(guò)提高腸上皮細(xì)胞SOD酶活性降低MDA含量，減少細(xì)胞損傷后導(dǎo)致的TNF的升高，提高機(jī)體對(duì)氧自由基清除能力，從而使線粒體免受脂質(zhì)過(guò)氧化的損傷。同時(shí)，由于穩(wěn)定了線粒體膜電位，提高了線粒體質(zhì)子轉(zhuǎn)運(yùn)和ATP合成，從而增加了Na+-K+-ATPase泵功能，抑制了Ca2+內(nèi)流而導(dǎo)致的Ca2+超載對(duì)線粒體的損傷，減輕了MPT的發(fā)生及細(xì)胞異常凋亡或壞死。 二、紫芪方提高損

14、傷細(xì)胞Bcl-2基因及其目的蛋白的表達(dá)：Bcl-2是一個(gè)廣義的抗細(xì)胞凋亡的基因，其功能是通過(guò)阻止細(xì)胞凋亡的早期環(huán)節(jié)而阻止凋亡的發(fā)生。它不能降低藥物誘導(dǎo)的DNA損傷，而是加速DNA的修復(fù)，即通過(guò)防止受損DNA轉(zhuǎn)錄出對(duì)細(xì)胞凋亡相關(guān)基因有激活作用的信號(hào)或阻止這些相關(guān)產(chǎn)物的作用，通過(guò)抑制自由基產(chǎn)生、抑制細(xì)胞內(nèi)鈣超載、抑制線粒體膜的通透性、阻止細(xì)胞色素C釋放及抑制caspase激活等機(jī)制發(fā)揮抑制細(xì)胞凋亡的作用。因此提高損傷細(xì)胞Bcl-2基因及其目

15、的蛋白的表達(dá)是紫芪方抑制細(xì)胞異常凋亡、發(fā)揮保護(hù)腸道屏障功能重要作用機(jī)制。 三、紫芪方增強(qiáng)實(shí)驗(yàn)大鼠腸道蠕動(dòng)功能：失血性休克導(dǎo)致腸道性缺血，腸道蠕動(dòng)功能下降，引起腸內(nèi)菌群內(nèi)穩(wěn)失調(diào)，腸黏膜通透性增加，細(xì)菌或內(nèi)毒素移位，使腸道從正常時(shí)的屏障防護(hù)變?yōu)槿硌装Y反應(yīng)的啟動(dòng)者。正常的腸蠕動(dòng)功能能夠減少病原菌在腸道的黏附與定殖，對(duì)于抑制病原菌的異常繁殖及減少病菌對(duì)機(jī)體的損傷十分重要。因此，紫芪方增強(qiáng)實(shí)驗(yàn)大鼠腸道蠕動(dòng)功能是其腸道屏障功能保護(hù)重要機(jī)制

16、之一。 四、此外，正常的腸道免疫功能及腸道微循環(huán)血流量等對(duì)于維護(hù)正常腸道功能十分重要，因此，紫芪方提高了實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的腸道免疫功能，并改善了腸道微循環(huán)血流量的作用也是其發(fā)揮其保護(hù)腸道屏障功能的重要機(jī)制。 結(jié)論：本研究成功構(gòu)建了保護(hù)腸道屏障功能的中藥復(fù)方-紫芪方；于體外和體內(nèi)模型上驗(yàn)證了紫芪方對(duì)損傷所致的腸上皮細(xì)胞、線粒體、腸屏障功能損傷的保護(hù)效應(yīng)；并從抗自由基損傷、線粒體功能保護(hù)、抑制細(xì)胞凋亡、提高Bcl-2基因及其目的蛋白