抗菌肽CWA對(duì)斷奶仔豬腸道炎癥和腸道屏障功能的作用及其機(jī)制.pdf

1、斷奶造成仔豬腸道功能紊亂，導(dǎo)致腹瀉、生長(zhǎng)性能下降甚至死亡，嚴(yán)重影響?zhàn)B豬業(yè)的健康發(fā)展。雖然腹瀉的影響因素較多，但多數(shù)研究表明腸道炎癥和腸道屏障功能損傷是斷奶仔豬易發(fā)生腹瀉的主要內(nèi)在原因。大量抗生素用于防治斷奶仔豬腹瀉，引發(fā)細(xì)菌耐藥性、肉產(chǎn)品中藥物殘留及環(huán)境污染等嚴(yán)重問(wèn)題;同時(shí)抗生素濫用會(huì)損害機(jī)體腸道屏障功能，破壞腸道穩(wěn)態(tài)?？咕氖侵匾南忍烀庖叻肿?，因其廣譜抗菌活性、破膜殺菌機(jī)制以及不易產(chǎn)生耐藥性等特點(diǎn)而受到關(guān)注。最新研究表明，抗菌肽不僅

2、具有免疫調(diào)節(jié)作用，還具有腸道上皮屏障保護(hù)功能。然而，抗菌肽應(yīng)用于防治斷奶仔豬腹瀉的效果及其對(duì)斷奶仔豬腸道炎癥和腸道上皮屏障功能的作用如何還不得而知。因此，在前期獲得了抗菌活性高、安全性好的抗菌肽CWA的基礎(chǔ)上，本研究開(kāi)展了抗菌肽CWA對(duì)斷奶仔豬腹瀉的防治效果試驗(yàn)，同時(shí)闡明了抗菌肽CWA對(duì)腸道炎癥和腸道屏障功能的作用;進(jìn)一步在小鼠上探究了抗菌肽CWA對(duì)細(xì)菌感染導(dǎo)致的腸道炎癥和腸道屏障功能損傷的作用;最后體外細(xì)胞試驗(yàn)初步探討了抗菌肽CWA緩

3、解腸道炎癥和保護(hù)腸道屏障功能的作用機(jī)制。主要研究結(jié)果如下:
　　試驗(yàn)一抗菌肽CWA對(duì)斷奶仔豬腸道炎癥和腸道屏障功能的作用
　　(1)抗菌肽CWA對(duì)斷奶應(yīng)激仔豬腸道炎癥的作用
　　選擇18頭健康的杜長(zhǎng)大仔豬，21日齡斷奶后分別腹腔注射3次生理鹽水（對(duì)照組）和抗菌肽CWA（抗菌肽CWA組），后續(xù)飼養(yǎng)7天，研究抗菌肽CWA對(duì)仔豬斷奶應(yīng)激腹瀉及其腸道炎癥的作用。結(jié)果表明，抗菌肽CWA降低了斷奶仔豬腹瀉指數(shù)（P＜0.05），提高

4、了斷奶仔豬ADFI(P＜0.05)和ADG(P＜0.05)。同時(shí)，抗菌肽CWA降低了血清IgG、TNF-α、IL-6、IL-22含量(P＜0.05)，且提高了血清中TGF-β含量(P＜0.05)。在腸道形態(tài)方面，抗菌肽CWA提高了空腸的絨毛高度、絨毛高度/隱窩深度比值(P＜0.05)，提高了回腸的絨毛高度/隱窩深度比值(P＜0.05)，降低了回腸的隱窩深度(P＜0.05)。在腸道炎癥方面，抗菌肽CWA降低了腸道中促炎因子的基因表達(dá)，其中

5、對(duì)空腸的效果最為顯著;同時(shí)抗菌肽CWA減少了腸道嗜中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞浸潤(rùn);提示抗菌肽CWA能夠緩解斷奶仔豬腸道炎癥。在腸道炎癥信號(hào)通路蛋白表達(dá)方面，抗菌肽CWA顯著降低空腸組織炎癥信號(hào)通路中關(guān)鍵蛋白NF-κB、IκB-α的磷酸化水平，提示抗菌肽CWA可能通過(guò)下調(diào)NF-κB信號(hào)通路緩解腸道炎癥。
　　(2)抗菌肽CWA對(duì)腹瀉斷奶仔豬腸道炎癥和腸道屏障功能的作用
　　選擇108頭腹瀉的杜長(zhǎng)大斷奶仔豬，分別腹腔注射4次生理鹽水（

6、對(duì)照組）、恩諾沙星（抗生素組）、抗菌肽CWA（抗菌肽CWA組），研究抗菌肽CWA對(duì)腹瀉斷奶仔豬腸道炎癥和腸道屏障功能的作用。結(jié)果表明，抗菌肽CWA和抗生素均降低了斷奶仔豬的腹瀉指數(shù)（P＜0.05）和腹瀉率（P＜0.05），均提高了斷奶仔豬ADFI（P＜0.05）和ADG(P＜0.05)，且兩者無(wú)顯著差異。在腸道形態(tài)方面，抗菌肽CWA和抗生素對(duì)小腸絨毛形態(tài)損傷均有緩解作用，其中對(duì)空腸的作用最顯著;掃描電鏡和透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，抗菌肽CWA和

7、抗生素改善了空腸微絨毛數(shù)量與長(zhǎng)度，且抗菌肽CWA的改善作用優(yōu)于抗生素。在腸道炎癥方面，抗菌肽CWA組和抗生素組均降低了空腸中促炎因子IL-6、IL-8、IL-22的含量(P＜0.05)，對(duì)血清也有類似規(guī)律;同時(shí)，抗菌肽CWA和抗生素均緩解了腹瀉斷奶仔豬空腸嗜中性粒細(xì)胞浸潤(rùn);進(jìn)一步，抗菌肽CWA組和抗生素組均降低了空腸組織中炎癥相關(guān)蛋白NF-κB、IκB-α、AKT的磷酸化水平及上游調(diào)控關(guān)鍵蛋白TLR4、MyD88的表達(dá);且抗菌肽CWA緩

8、解腸道炎癥的作用與抗生素相當(dāng)。在腸道上皮屏障功能方面，抗生素組不僅降低了空腸粘液素和防御素的表達(dá)，而且降低了空腸中緊密連接蛋白ZO-1和Occludin的表達(dá)（P＜0.05）;然而，抗菌肽CWA卻提高了空腸中ZO-1和Occludin的表達(dá)（P＜0.05）;提示抗菌肽CWA可能提高腸道上皮屏障功能而抗生素卻損害腸道上皮屏障功能。在腸道微生物菌群及SCFAs含量方面，與對(duì)照組相比，抗菌肽CWA組和抗生素組均降低了糞便中大腸桿菌比例(P＜0

9、.05)，均提高了糞便中乳酸桿菌/大腸桿菌比值(P＜0.05);然而，抗菌肽CWA提高了糞便中乳酸桿菌比例(P＜0.05)，抗生素卻降低了糞便中乳酸桿菌比例(P＜0.05);進(jìn)一步，抗菌肽CWA提高了糞便中乙酸、丙酸及丁酸的濃度(P＜0.05)，而抗生素降低了糞便中丁酸的濃度、丁酸/乙酸比值及丁酸/丙酸比值(P＜0.05)。
　　試驗(yàn)二抗菌肽CWA對(duì)細(xì)菌感染小鼠腸道炎癥和腸道屏障功能的作用
　　在發(fā)現(xiàn)抗菌肽CWA緩解斷奶仔豬

10、腸道炎癥和腸道屏障功能損傷的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步在小鼠上研究抗菌肽CWA對(duì)細(xì)菌感染引起的腸道炎癥和腸道屏障功能損傷的影響。選擇36只斷奶小鼠分為對(duì)照組、E.coli組、E.coli+Enro組、E.coli+CWA組，EHEC O157∶H7感染后分別腹腔注射生理鹽水、恩諾沙星(Enro)、抗菌肽CWA。結(jié)果表明，抗菌肽CWA和恩諾沙星均提高了染菌小鼠的存活率，緩解了染菌導(dǎo)致的小鼠體重下降。在腸道形態(tài)方面，抗菌肽CWA和恩諾沙星均緩解了染菌導(dǎo)

11、致的小鼠空腸絨毛萎縮、隱窩增生和結(jié)腸粘膜上皮破損、杯狀細(xì)胞數(shù)量增加。在炎癥方面，E.coli+Enro組和E.coli+CWA組均緩解了染菌導(dǎo)致的小鼠血清和結(jié)腸中TNF-α、IL-6、IL-10含量升高(P＜0.05);同時(shí)均緩解了染菌導(dǎo)致的小鼠空腸中IL-6含量的升高(P＜0.05);抗菌肽CWA在緩解炎癥方面與恩諾沙星無(wú)顯著差異。在腸道抗菌蛋白表達(dá)方面，E.coli+Enro組和E.coli+CWA組均緩解了染菌導(dǎo)致的空腸中REG3

12、γ基因表達(dá)升高和結(jié)腸中Remlβ基因表達(dá)升高(P＜0.05)。然而，抗菌肽CWA組了小鼠空腸和結(jié)腸中TFF3基因表達(dá)水平（P＜0.05）。同時(shí)，E.coli+Enro組和E.coli+CWA組均緩解了染菌導(dǎo)致的小鼠空腸中杯狀細(xì)胞數(shù)量減少、粘液層厚度降低和結(jié)腸中杯狀細(xì)胞數(shù)量增加。進(jìn)一步，Western blot和免疫熒光的結(jié)果表明，E.coli+Enro組和E.coli+CWA組均緩解了染菌導(dǎo)致的小鼠空腸MUC-2表達(dá)的降低和結(jié)腸MUC-

13、2表達(dá)的升高（P＜0.05）。在腸道上皮屏障功能方面，E.coli+CWA組緩解了染菌導(dǎo)致的小鼠空腸中ZO-1和Occludin蛋白表達(dá)的下降（P＜0.05），而E.coli+Enro組僅緩解了ZO-1蛋白表達(dá)的下降(P＜0.05)，抗菌肽CWA的效果優(yōu)于抗生素。在腸道微生物菌群及SCFAs濃度方面，不同處理小鼠盲腸內(nèi)容物中總菌、雙歧桿菌、芽孢桿菌的數(shù)量無(wú)顯著差異，E.coli+Enro組和E.coli+CWA組均緩解了染菌導(dǎo)致的盲腸中

14、乳酸桿菌數(shù)量的降低和大腸桿菌數(shù)量的升高（P＜0.05），同時(shí)E.coli+CWA組緩解了染菌導(dǎo)致的盲腸中乳酸桿菌/大腸桿菌比值的下降（P＜0.05）。同時(shí)，Ecoli+CWA組和E.coli+Enro組均對(duì)染菌導(dǎo)致的SCFAs濃度的降低具有一定程度的緩解作用。以上結(jié)果進(jìn)一步證明了抗菌肽CWA能夠緩解腸道炎癥和改善腸道屏障功能，與斷奶仔豬的試驗(yàn)結(jié)果一致。
　　試驗(yàn)三抗菌肽CWA對(duì)腸道炎癥和腸道上皮屏障功能的調(diào)控機(jī)制
　　(1)

15、抗菌肽CWA緩解腸道炎癥的作用機(jī)制
　　利用LPS誘導(dǎo)的豬巨噬細(xì)胞炎癥模型發(fā)現(xiàn)，恩諾沙星對(duì)LPS導(dǎo)致的炎癥反應(yīng)無(wú)緩解作用，而抗菌肽CWA可以緩解LPS導(dǎo)致的炎癥反應(yīng)且呈濃度依賴效應(yīng)。同時(shí)，抗菌肽CWA緩解了LPS導(dǎo)致的IL-6、IL-8、IL-22表達(dá)升高和NF-κB、IκB-α磷酸化水平升高(P＜0.05)。利用siRNA技術(shù)沉默豬巨噬細(xì)胞TLR4和MyD88后，抗菌肽CWA緩解炎癥的作用受到抑制。利用FITC標(biāo)記的葡聚糖和流式

16、細(xì)胞檢測(cè)技術(shù)發(fā)現(xiàn)，抗菌肽CWA可以增強(qiáng)巨噬細(xì)胞吞噬FITC-葡聚糖的能力，而使用STAT-1抑制劑后，抗菌肽CWA對(duì)巨噬細(xì)胞吞噬功能的增強(qiáng)作用受到抑制。以上結(jié)果表明，抗菌肽CWA緩解腸道炎癥可能是通過(guò)TLR4-MyD88-NF-κB信號(hào)通路調(diào)控炎癥反應(yīng)和通過(guò)STAT-1途徑增強(qiáng)巨噬細(xì)胞吞噬功能等機(jī)制發(fā)揮作用。
　　(2)抗菌肽CWA改善腸道上皮屏障功能的作用機(jī)制
　　利用Caco-2細(xì)胞刮傷模型發(fā)現(xiàn)，抗菌肽CWA提高了刮傷細(xì)

17、胞的愈合速度，改善受損腸道上皮細(xì)胞的修復(fù)功能。利用豬空腸上皮細(xì)胞(IPEC-J2)屏障功能損傷模型發(fā)現(xiàn)，抗菌肽CWA緩解了LPS導(dǎo)致的IPEC-J2單層細(xì)胞TER值的下降，同時(shí)緩解了LPS導(dǎo)致的腸道上皮細(xì)胞中緊密連接蛋白ZO-1和Occludin蛋白表達(dá)的下降。單獨(dú)添加抗菌肽CWA提高了IPEC-J2細(xì)胞中ZO-1和Occludin的表達(dá)，而添加Rac1抑制劑NSC23766時(shí)，抗菌肽CWA對(duì)ZO-1和Occludin的提高作用受到抑制