新型丁酸梭菌篩選及其對(duì)斷奶仔豬生長(zhǎng)性能和腸道功能影響的研究.pdf

1、本研究從有效保護(hù)和改善斷奶仔豬腸道屏障功能和免疫功能的角度出發(fā)，以分泌抗菌肽為目標(biāo)，從仔豬腸道內(nèi)容物中篩選、鑒定得到發(fā)酵上清液具有較強(qiáng)抑菌活性的丁酸梭菌ZJU-F1，首先研究了其體外生物學(xué)活性、體內(nèi)定植特性和安全性;然后對(duì)其發(fā)酵液中抗菌肽CBP22進(jìn)行分離、鑒定，并探討了抗菌肽CBP22對(duì)LPS誘導(dǎo)小鼠腸炎的保護(hù)作用;在此基礎(chǔ)上，研究了丁酸梭菌ZJU-F1在日糧中替代抗生素并降低氧化鋅劑量對(duì)斷奶仔豬生長(zhǎng)性能、消化功能、腸道屏障功能的影響

2、;最后通過(guò)體內(nèi)和體外試驗(yàn)研究丁酸梭菌ZJU-F1對(duì)仔豬免疫功能的影響及其可能機(jī)制。主要研究結(jié)果如下:
　　試驗(yàn)一、新型丁酸梭菌篩選
　　丁酸梭菌篩選、鑒定和體外生物學(xué)活性:采用厭氧培養(yǎng)法進(jìn)行菌種分離，孔穴瓊脂擴(kuò)散法進(jìn)行抑菌活性篩選，從仔豬盲腸內(nèi)容物中分離到6株丁酸梭菌，其中3株菌種發(fā)酵上清液對(duì)E.coli K88、S.aureus ATCC25923均具有明顯抑制作用，并確定其抑菌物質(zhì)是蛋白質(zhì)或多肽，選取發(fā)酵上清液抑菌活性最

3、強(qiáng)的丁酸梭菌ZJU-F1為目標(biāo)菌株。進(jìn)一步研究表明丁酸梭菌ZJU-F1具有較快的生長(zhǎng)速度，耐溫、耐酸、耐膽鹽，且對(duì)多種抗生素耐受，該菌種保藏于中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心。
　　丁酸梭菌產(chǎn)酶、產(chǎn)酸、產(chǎn)維生素特性:比較了6株不同來(lái)源的丁酸梭菌產(chǎn)酸、產(chǎn)酶和產(chǎn)維生素能力。丁酸梭菌ZJU-1分泌淀粉酶和蛋白酶活性分別達(dá)2515.43 U/mL和93.72U/mL，顯著高于丁酸梭菌CGMCC1.209(p＜0.05);乙酸和丁酸的分泌量分

4、別達(dá)2.29 g/L和1.67g/L，顯著高于丁酸梭菌CGMCC1.335(p＜0.05);維生素B3的產(chǎn)量達(dá)175.95μg/L，顯著高于丁酸梭菌S1、丁酸梭菌CGMCC1.209、丁酸梭菌CGMCC1.335和丁酸梭菌CGMCC1.336(p＜0.05)。結(jié)果表明丁酸梭菌ZJU-F1具有較強(qiáng)的產(chǎn)酶、產(chǎn)酸和產(chǎn)維生素的特性。
　　丁酸梭菌ZJU-F1的體內(nèi)定植特性:灌胃2×108 CFU經(jīng)抗生素抗性篩選的丁酸梭菌ZJU-F1考察其

5、在小鼠腸道內(nèi)的分布和定植情況。結(jié)果表明，灌胃后1d，小鼠各腸段中丁酸梭菌ZJU-F1的粘附數(shù)量最高，其后數(shù)量逐漸降低，灌胃后第7d數(shù)量低于103 CFU，其主要粘附部位為回腸、盲腸和結(jié)腸黏膜，結(jié)果表明丁酸梭菌ZJU-F1能在動(dòng)物體內(nèi)定植，主要定植部位為后腸。
　　丁酸梭菌ZJU-F1的安全性評(píng)價(jià):采用小鼠急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)評(píng)價(jià)該菌株的安全性。結(jié)果表明，小鼠對(duì)丁酸梭菌菌懸液（1.2×109 CFU/g）經(jīng)口毒性試驗(yàn)最大耐受量大于20.

6、0g/Kg體重，依據(jù)GB15193.3-2014判定為實(shí)際無(wú)毒，表明丁酸梭菌ZJU-F1可作為一種潛在的安全飼料添加劑。
　　試驗(yàn)二、丁酸梭菌抗菌肽的分離、鑒定及其對(duì)LPS腸炎小鼠的保護(hù)作用研究
　　抗菌肽分離、鑒定:經(jīng)硫酸銨沉淀、親和層析、陽(yáng)離子交換和反向高效液相色譜的方法分離純化丁酸梭菌ZJU-F1分泌的抗菌肽CBP22，是由22個(gè)氨基酸組成的線性肽，分子量是2264.6 Da，等電點(diǎn)8.64，該抗菌肽對(duì)E.coli K

7、88、S.aureus ATCC25923的最小抑菌濃度分別為32μg/mL、64μg/mL。
　　CBP22對(duì)LPS誘導(dǎo)小鼠腸炎保護(hù)的作用研究:在抗菌肽CBP22抑菌活性研究的基礎(chǔ)上，開(kāi)展了其對(duì)LPS誘導(dǎo)的腸炎小鼠腸道屏障功能和免疫功能的影響。
　　腸道屏障功能研究結(jié)果:腸道通透性方面，CBP22預(yù)處理組能顯著緩解LPS引起的小鼠的腸道通透性增加(p＜0.05)，達(dá)到正常對(duì)照組水平;腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)和細(xì)胞凋亡方面，CBP22預(yù)

8、處理組小鼠在LPS處理后，空腸絨毛高度高于LPS處理組。緊密連接蛋白基因表達(dá)方面，腹腔注射CBP22可以顯著緩解因LPS引起的空腸ZO-1和ZO-2基因表達(dá)的下調(diào)(p＜0.05)。結(jié)果提示腹腔注射CBP22可緩解LPS引起的空腸絨毛損傷和腸上皮細(xì)胞凋亡、脫落，維持腸道屏障功能。
　　免疫功能研究結(jié)果:結(jié)果提示，CBP22顯著緩解LPS引起的小鼠血清IgG、IgA、IgM和TNF-α的升高，并降低回腸sIgA水平和TNF-α基因表達(dá)

9、。
　　試驗(yàn)三、丁酸梭菌ZJU-F1對(duì)斷奶仔豬生長(zhǎng)性能、消化功能和屏障功能的影響
　　選取150頭23±2日齡“杜×長(zhǎng)×大”三元雜交斷奶仔豬，隨機(jī)分為5組:2250mg/Kg Zn+抗生素組（基礎(chǔ)日糧+2250 mg/Kg鋅+抗生素）、1125 mg/Kg Zn+抗生素組（基礎(chǔ)日糧+1125 mg/Kg鋅+抗生素）、地衣芽孢桿菌組（基礎(chǔ)日糧+1125mg/Kg鋅+109 CFU/Kg地衣芽孢桿菌）、丁酸梭菌組（基礎(chǔ)日糧+11

10、25mg/Kg鋅+108 CFU/Kg丁酸梭菌ZJU-F1）、復(fù)合菌組(基礎(chǔ)日糧+1125mg/Kg鋅+109 CFU/Kg地衣芽孢桿菌+108 CFU/Kg丁酸梭菌ZJU-F1)，鋅均為氧化鋅形式添加，試驗(yàn)期14天，從生長(zhǎng)性能、消化功能、腸道屏障功能等角度探討丁酸梭菌ZJU-F1替代抗生素并降低氧化鋅劑量的可行性。
　　生長(zhǎng)性能和腹瀉率結(jié)果表明:丁酸梭菌ZJU-F1及其復(fù)合菌制劑可以較好地替代抗生素并降低氧化鋅的使用劑量。

11、>　　消化功能結(jié)果表明:消化酶活性方面，與1125mg/KgZn+抗生素組相比，丁酸梭菌組和復(fù)合菌組能顯著提高十二指腸淀粉酶、空腸淀粉酶和脂肪酶活性(p＜0.05)，達(dá)到2250mg/Kg Zn+抗生素組水平。表觀消化率方面，丁酸梭菌組和復(fù)合菌組顯著提高干物質(zhì)、粗蛋白、鈣和磷的表觀消化率(p＜0.05)，達(dá)到2250mg/Kg Zn+抗生素組水平。結(jié)果提示，丁酸梭菌ZJU-F1及其復(fù)合菌可能通過(guò)分泌消化酶來(lái)輔助消化，提高飼料營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的表

12、觀消化率。
　　腸道屏障功能結(jié)果:
　　腸道通透性方面，丁酸梭菌ZJU-F1及其復(fù)合菌能緩解因斷奶引起的腸道通透性增加，并能明顯改善斷奶仔豬腸道形態(tài)，促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)素的吸收，進(jìn)而提高生長(zhǎng)性能。
　　體內(nèi)緊密連接蛋白表達(dá)方面，丁酸梭菌ZJU-F1可以促進(jìn)腸道緊密連接蛋白基因和蛋白的表達(dá)，增強(qiáng)豬腸道的分子屏障功能。
　　體內(nèi)小腸黏蛋白基因表達(dá)方面，丁酸梭菌ZJU-F1及其復(fù)合菌制劑可以促進(jìn)小腸上皮黏蛋白的分泌，增強(qiáng)豬腸道化

13、學(xué)屏障功能。
　　腸道微生物區(qū)系方面，飼料日糧中添加丁酸梭菌ZJU-F1和復(fù)合菌可以改善腸道菌群、促進(jìn)腸道菌群結(jié)構(gòu)優(yōu)化，并提高SCFA含量，進(jìn)而增強(qiáng)仔豬腸道微生物屏障功能。
　　試驗(yàn)四、丁酸梭菌ZJU-F1對(duì)豬免疫功能的影響及機(jī)制研究
　　在研究了丁酸梭菌ZJU-F1及其復(fù)合菌制劑對(duì)斷奶仔豬生長(zhǎng)性能、消化功能和腸道屏障功能有改善作用的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步通過(guò)體內(nèi)和體外試驗(yàn)研究了丁酸梭菌ZJU-F1對(duì)免疫功能的影響及可能機(jī)制。

14、
　　丁酸梭菌ZJU-F1對(duì)斷奶仔豬免疫功能影響:體內(nèi)體液免疫功能結(jié)果表明，與1125mg/Kg Zn+抗生素組相比，丁酸梭菌組和復(fù)合菌組提高血清中IgA的含量和補(bǔ)體C3、C4水平(p＜0.05);細(xì)胞因子方面，與1125 mg/Kg Zn+抗生素組相比，丁酸梭菌組和復(fù)合菌組顯著降低促炎因子IL-6、TNF-α、IFN-γ含量(p＜0.05)?？咕谋磉_(dá)結(jié)果顯示，與1125mg/Kg Zn+抗生素組相比，丁酸梭菌組和復(fù)合菌組顯著提

15、高了骨髓中PR-39、PG1-5和PMAP23、肝臟中Hepecidin和PR-39、胸腺中PR-39、腸系膜淋巴結(jié)中PR-39和PG1-5、回腸中pBDs和PR-39的基因表達(dá)(p＜0.05)，并顯著高于2250 mg/Kg Zn+抗生素組(p＜0.05)。結(jié)果表明，丁酸梭菌ZJU-F1及其復(fù)合菌制劑可以通過(guò)提高血清中免疫球蛋白水平、降低促炎因子表達(dá)，并提高抗先天免疫因子抗菌肽的表達(dá)來(lái)提高斷奶仔豬免疫性能和抗病力，這可能與丁酸梭菌分泌

16、的丁酸和抗菌肽有關(guān)。
　　腸黏膜炎癥細(xì)胞因子方面，丁酸梭菌ZJU-F1及其復(fù)合菌制劑通過(guò)提高回腸促炎因子表達(dá)和sIgA水平來(lái)改善腸道黏膜免疫功能。
　　丁酸梭菌ZJU-F1對(duì)IPEC-J2細(xì)胞粘附作用:丁酸梭菌ZJU-F1能使大腸桿菌K88的粘附率分別降低至3.87％和7.05％。結(jié)果提示丁酸梭菌ZJU-F1能在腸道上皮細(xì)胞粘附并抑制致病菌的粘附，促進(jìn)腸道健康。
　　體外細(xì)胞試驗(yàn)揭示丁酸梭菌ZJU-F1能夠刺激IPEC

17、-J2細(xì)胞TLR-2基因的表達(dá)，進(jìn)而活化NF-κ3，誘導(dǎo)骨髓樣分化因子MyD88的表達(dá);丁酸梭菌ZJU-F1顯著提高豬腸道上皮細(xì)胞IPEC-J2促炎因子TNF-α、IL-1β以及趨化因子IL-8、抑炎因子IL-4、IL-10的基因表達(dá)(p＜0.05)。提示丁酸梭菌ZJU-F1可能是通過(guò)激活TLR-2介導(dǎo)的MyD88信號(hào)通路途徑，引起腸上皮細(xì)胞促炎因子和抑炎因子的表達(dá)來(lái)增加腸道黏膜免疫功能。
　　綜上所述，本研究以分泌具有高效抗菌活