T3調(diào)控下丘腦GT1-7神經(jīng)元細(xì)胞KISS-1基因表達(dá)的研究.pdf

1、目的：
　　研究T3對(duì)下丘腦GT1-7神經(jīng)元細(xì)胞中KISS-1基因表達(dá)的影響。
　　方法：
　　1、利用RT-PCR的方法驗(yàn)證GT1-7細(xì)胞中KISS-1基因表達(dá)。
　　2、分別用realtime PCR和western blotting的方法，觀察200ng/ml T3作用GT1-7神經(jīng)元細(xì)胞不同時(shí)間(12、24、48、72h)后KISS-1基因mRNA和蛋白表達(dá)的變化。
　　3、用TRα、TRβsiRN

2、A轉(zhuǎn)染GT1-7細(xì)胞，western blotting檢測(cè)干擾效果，選擇有效的干擾序列轉(zhuǎn)染GT1-7細(xì)胞后，T3干預(yù)GT1-7細(xì)胞24h，用realtime PCR方法測(cè)定KISS-1基因mRNA表達(dá)。
　　4、構(gòu)建2kb的KISS-1啟動(dòng)子報(bào)告基因體系（PGL3-Kiss1 promoter），不同濃度(0、20、200、2000ng/ml)T3作用GT1-7神經(jīng)元細(xì)胞24h后，運(yùn)用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)測(cè)定KISS-1啟動(dòng)

3、子活性的變化。
　　結(jié)果：
　　1、RT-PCR顯示140bpKISS-1條帶。
　　2、realtime PCR結(jié)果顯示：200ng/ml T3作用GT1-7神經(jīng)元細(xì)胞不同時(shí)間（12-72h)后，與0h對(duì)照組相比，12h組KISS-1 mRNA表達(dá)增加，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p>0.05），24h、48h、72h組KISS-1 mRNA表達(dá)顯著增加（p<0.01），其中48h組KISS-1mRNA表達(dá)增加最明顯。
　

4、　3、western blotting結(jié)果顯示：200ng/ml T3作用GT1-7神經(jīng)元細(xì)胞不同時(shí)間（12-72h)后，與0h對(duì)照組相比，12h組KISS-1蛋白表達(dá)開(kāi)始增加，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p>0.05），24h、48h、72h組KISS-1蛋白表達(dá)顯著增加（p<0.01），其中24h組KISS-1蛋白表達(dá)增加最明顯。
　　4、siRNA轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)結(jié)果：TRα、TRβsiRNA轉(zhuǎn)染GT1-7細(xì)胞48小時(shí)后，siRNA664、si

5、RNA1259組TR蛋白表達(dá)下降。選擇有效的siRNA轉(zhuǎn)染GT1-7細(xì)胞，200ng/ml T3干預(yù)細(xì)胞24h，與對(duì)照組相比，siRNA664組KISS-1 mRNA表達(dá)明顯降低（p<0.01），siRNA1259組KISS-1 mRNA表達(dá)降低（p<0.05）。
　　5、雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)結(jié)果：與對(duì)照組相比，20ng/ml、200ng/ml、2000ng/ml組KISS-1啟動(dòng)子活性增強(qiáng)，其中200ng/ml組增強(qiáng)作用最明顯（p