封閉連續(xù)細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)流感病毒工藝過程關(guān)鍵技術(shù)的研究.pdf

1、流行性感冒是由流感病毒引起的一種急性呼吸道傳染病，在季節(jié)性流行時，能在全世界迅速傳播，造成大量的經(jīng)濟(jì)損失和社會危害，全世界每年約有10億人口感染流感病毒，其中重癥病例300～500萬，死亡人數(shù)25～50萬，免疫接種流感疫苗仍是最為有效和經(jīng)濟(jì)的方式。與傳統(tǒng)雞胚生產(chǎn)方法相比，動物細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)流感方法具有很多優(yōu)勢，如抗原匹配性好，能夠?qū)崿F(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)和自動化控制，可以在短時間內(nèi)大量生產(chǎn)流感疫苗，減少過敏反應(yīng)等。世界衛(wèi)生組織鼓勵各國發(fā)展細(xì)胞培養(yǎng)技

2、術(shù)生產(chǎn)流感疫苗。 ⑴提出了一個包括細(xì)胞培養(yǎng)、病毒生產(chǎn)和病毒滅活在內(nèi)的封閉、連續(xù)、在位滅活的細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)滅活病毒疫苗新工藝。通過連續(xù)操作，能夠在較少空間內(nèi)快速大量生產(chǎn)病毒。通過將細(xì)胞培養(yǎng)和病毒生產(chǎn)過程分開，可以把病毒生產(chǎn)過程安置在一個較小的高安全等級空間內(nèi)進(jìn)行，大大提高了操作安全性和降低了病毒泄漏危險(xiǎn)性，尤其適合那些高致病性、高危險(xiǎn)性病毒疫苗的制備過程。 ⑵針對封閉連續(xù)工藝過程的一些關(guān)鍵技術(shù)開展研究，包括細(xì)胞對流感病毒敏感

3、性分析、細(xì)胞微載體培養(yǎng)生產(chǎn)病毒工藝、細(xì)胞珠到珠轉(zhuǎn)移、轉(zhuǎn)移后細(xì)胞對病毒增殖敏感性驗(yàn)證、細(xì)胞無血清培養(yǎng)生產(chǎn)流感病毒、代謝分析、可模擬連續(xù)操作的多次間歇式珠到珠轉(zhuǎn)移培養(yǎng)細(xì)胞生產(chǎn)流感病毒等方面。 ⑶考察了Vero細(xì)胞對H9N2禽流感病毒的敏感性。發(fā)現(xiàn)H9N2病毒經(jīng)過在Vero細(xì)胞上連續(xù)傳代，會逐漸適應(yīng)，可以產(chǎn)生高血凝滴度的流感病毒，當(dāng)TPCK胰酶為1.5μg/mL，pH值7.0～7.6時，血凝滴度可達(dá)2.2～2.3logHAunit/1

4、00μL。 ⑷研究了細(xì)胞微載體培養(yǎng)生產(chǎn)流感病毒的可行性，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞最適培養(yǎng)條件是：接種密度為2.0×105cells/mL、Cytodex3含量為2g/L、轉(zhuǎn)速35rpm。3天左右，微載體上基本長滿細(xì)胞，細(xì)胞密度約為9.7×105cells/mL。接著用DMEM培養(yǎng)基生產(chǎn)流感病毒H9N2，當(dāng)感染復(fù)數(shù)為0.1時，病毒感染48h后，空斑形成單位達(dá)到最大值，約為5.8logPFU/mL，此時收集病毒，可以適合減毒活疫苗的制備；病毒感染6

5、0～72h后，病毒HA滴度達(dá)到最大值，約為2.1～2.21ogHAunit/100μL，此時收集病毒，適合滅活疫苗的制備。 ⑸考察了Vero細(xì)胞在Cytodex3微載體間通過珠到珠轉(zhuǎn)移的可行性，發(fā)現(xiàn)Vero細(xì)胞主要依靠載體間形成的細(xì)胞橋?qū)崿F(xiàn)珠到珠轉(zhuǎn)移，5μg/mL胰酶并不能促進(jìn)細(xì)胞在載體間轉(zhuǎn)移。本文應(yīng)用田口方法首次分析了影響建橋率的因素。攪拌時間、靜止時間兩個因素和攪拌時間/靜止時間、攪拌速度/靜止時間兩個相互作用對新老微載體之

6、間細(xì)胞橋的形成過程有顯著影響。在新老載體比例為2:1的放大中，間歇攪拌8h，新載體建橋率在21％左右，然后以35rpm連續(xù)攪拌，新老載體混合6天后，載體空載率降到2％左右，細(xì)胞密度達(dá)到1.3×106cells/mL。Vero細(xì)胞珠到珠轉(zhuǎn)移后，接種流感病毒，血凝滴度逐漸增加，4天后穩(wěn)定在2.1～2.21ogHAunit/100μL，說明珠到珠轉(zhuǎn)移方法適合Vero細(xì)胞生產(chǎn)流感病毒，這為流感病毒擴(kuò)大生產(chǎn)提供了一條簡單路線。 ⑹考察了E

7、X-CELLTMVero無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)Vero細(xì)胞生產(chǎn)流感病毒的情況。發(fā)現(xiàn)Cytodex3比Cytodex1對Vero細(xì)胞的接種效率更高，采用每隔30min以35rpm轉(zhuǎn)速攪拌3min的間歇攪拌方式，在200mg/LCaCl2促進(jìn)下，經(jīng)過8h間歇攪拌，細(xì)胞接種效率在53％左右。無血清培養(yǎng)可以培養(yǎng)Vero細(xì)胞生產(chǎn)流感病毒，其中細(xì)胞生長速度比用含血清培養(yǎng)基培養(yǎng)時慢，需要4天到達(dá)穩(wěn)定生長期，但病毒增殖情況在兩者中沒有明顯差異。同時發(fā)現(xiàn)無血清

8、培養(yǎng)細(xì)胞后無需換液，直接接種病毒，仍能夠獲得滿意的病毒增殖效果，病毒滴度在2.11ogHAunit/100μL左右，這對生產(chǎn)工藝過程的簡化十分有利。 ⑺本實(shí)驗(yàn)采用多次間歇加料的方式來模擬連續(xù)培養(yǎng)過程，經(jīng)過4次新老載體1:4比例的放大培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞密度可以保持穩(wěn)定，而病毒產(chǎn)量有輕微下降的趨勢，這可能是由于病毒生長環(huán)境比較惡劣的緣故。同時對懸浮細(xì)胞生產(chǎn)流感病毒的封閉連續(xù)系統(tǒng)進(jìn)行了展望，對有關(guān)動力學(xué)參數(shù)的測定建立了相關(guān)數(shù)學(xué)公式模型，希