細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)cellculturetechnique

1、第二講 正常和腫瘤組織細(xì)胞培養(yǎng),溫州醫(yī)學(xué)院檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)院陶志華,內(nèi) 容,正常組織細(xì)胞培養(yǎng) 上皮細(xì)胞的體外培養(yǎng) 血管內(nèi)皮細(xì)胞的體外培養(yǎng) 腎小管上皮細(xì)胞的培養(yǎng) 巨噬細(xì)胞的培養(yǎng) 淋巴細(xì)胞的培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞培養(yǎng),上皮組織的體外培養(yǎng),上皮細(xì)胞的基本特征：,1.上皮組織的形態(tài)結(jié)構(gòu) 群體依賴性（population dependence)

2、 接觸抑制（contact inhibition) 2.上皮細(xì)胞的極性 貼壁依賴性細(xì)胞-貼壁生長 生長基質(zhì) 3 . 上皮細(xì)胞間的連接,體外培養(yǎng)的上皮組織細(xì)胞的生長生物學(xué),1. 形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)： 均質(zhì)性、透明性很強(qiáng)，結(jié)構(gòu)不明顯,2. 體外培養(yǎng)上皮組織的生長與增殖特征,(1) 體外培養(yǎng)的特殊條件

3、： a. 防范微生物污染 b. 生長基質(zhì)的基質(zhì) c. 特殊的培養(yǎng)基 M199 RPMI1640 DMEM Fam F12 無血清培養(yǎng)基 d. 去成纖維細(xì)胞,(2) 體外培養(yǎng)上皮細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化,(3) 體外培養(yǎng)上皮細(xì)胞的生存狀態(tài),體內(nèi)：機(jī)體自身神經(jīng)和內(nèi)分泌因素 體外：促細(xì)胞增殖

4、因子和促細(xì)胞分化因子,細(xì)胞增殖態(tài)細(xì)胞分化態(tài),體外培養(yǎng)上皮組織細(xì)胞的觀察與檢測,1. 一般形態(tài)學(xué)觀察 光鏡： 形態(tài)、輪廓、生長情況等。 細(xì)胞規(guī)則、明亮而飽滿、細(xì)胞輪廓不清 電鏡： 橋粒、形態(tài)結(jié)構(gòu)特征、細(xì)胞間關(guān)系培養(yǎng)液pH變化：

5、 顏色變化？培養(yǎng)物的污染情況： 透明度變化？,2. 組織化學(xué)與免疫組織化學(xué)觀察與檢測酶類： 堿性磷酸酶 琥珀酸脫氫酶特異性抗原標(biāo)記物： 角蛋白、上皮細(xì)胞膜抗原

6、 VIII因子、晶體蛋白、唾液酸糖蛋白,血管內(nèi)皮細(xì)胞的體外培養(yǎng),人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的培養(yǎng),組織來源： 嬰兒臍帶培養(yǎng)用液： M199+20%FCS D-Hanks 0.1%膠原酶溶液培養(yǎng)用具：,1.主要材料：,2.培養(yǎng)方法：,分離細(xì)胞培養(yǎng)法,(1) 關(guān)于接種材料的制備 取材與消化

7、 消化酶、濃度、時(shí)間 (2) 排除成纖維細(xì)胞 傳代去除法 加肝素培養(yǎng)法(90u/ml) 刮除法 (3) 關(guān)于培養(yǎng)液 (4) 關(guān)于傳代培養(yǎng),5.討論：,(1) 光鏡檢查 (2) 透射電鏡檢查： W-P小體 (3) V

8、III因子相關(guān)抗原的免疫組化檢測,6. 內(nèi)皮細(xì)胞的鑒定：,腎小管上皮細(xì)胞的培養(yǎng),1. 主要材料： a. 細(xì)胞來源： b. 無血清培養(yǎng)液： 基礎(chǔ)培養(yǎng)液： DMEM/HamF12(1:1) 添加物：

9、 胰島素 5?g/ml 轉(zhuǎn)鐵蛋白5 ? g/ml 硒 5 ? g/ml 氫化可的松36ng/ml

10、 T3 4 ng/ml EGF 10 ? g/ml,c. 消化液： 0.2%胰蛋白酶d. 細(xì)胞篩網(wǎng)： 80和100目,2.原代培養(yǎng)：

11、切取1cm3外層腎皮質(zhì)、剪碎成1mm3 80目研磨沖洗、于100目上收集腎小管節(jié)段0.2%胰蛋白酶消化、調(diào)整細(xì)胞數(shù)接種于纖維連接蛋白包被的培養(yǎng)瓶進(jìn)行培養(yǎng)每隔3~4天，更換培養(yǎng)液,,,,,3.傳代培養(yǎng)：4. 培養(yǎng)結(jié)果： 3d 長出細(xì)胞 5~7d 進(jìn)入對數(shù)生長期 7~9d

12、 融合成單細(xì)胞層5.鑒定： 抗角蛋白抗體染色（+）,6.注意事項(xiàng)：,a. 分離方法：b. 鑒定方法：,巨噬細(xì)胞的培養(yǎng),巨噬細(xì)胞的培養(yǎng),動(dòng)物： 小鼠、大鼠、兔、人培養(yǎng)基： Eagle MEM RPMI164

13、0 HamF12常用的巨噬細(xì)胞： 肺泡和腹腔巨噬細(xì)胞,獲取巨噬細(xì)胞的方法,（一）肺泡巨噬細(xì)胞 支氣管肺泡灌洗法 支氣管鏡肺泡灌洗法（二）腹腔巨噬細(xì)胞 1. 小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的獲取： (1)主要材料：

14、 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物: 6周齡小鼠 培養(yǎng)液： 10%FCS RPMI1640,巨噬細(xì)胞的純化,1、原理： 巨噬細(xì)胞黏附能力強(qiáng)、貼壁快特點(diǎn) 貼附培養(yǎng)時(shí)間 貼附培養(yǎng)溫度2. 方法： 常規(guī)差速黏附處理：

15、 低溫差速黏附處理：,巨噬細(xì)胞的接種和培養(yǎng),（一）主要材料： 培養(yǎng)液： RPMI1640 等+10~40%FCS+抗生素 （二）實(shí)驗(yàn)步驟： a. 冷分離 b. 調(diào)整細(xì)胞濃度：2~4×106/ml c. 接種培養(yǎng),（三）培養(yǎng)結(jié)果：,大 小：

16、20~50?m形 態(tài)： 菱形、星形、圓形功 能： 吞噬功能增殖情況： 不增殖、存活1~3周,（四）巨噬細(xì)胞的鑒定1. 吞噬實(shí)驗(yàn)： 加入0.001M(final con.)SiO2 吞噬泡2. 抗胰蛋白酶消化能力試驗(yàn)： 0.25%胰蛋白酶消化20min、再用吸管反復(fù)吹打

17、 細(xì)胞變園但不脫落3. 細(xì)胞化學(xué)試驗(yàn)： ACP酶染色：棕黑色 NSE酶染色：紫藍(lán)色,淋巴細(xì)胞的培養(yǎng),各類淋巴細(xì)胞的主要特征,表面標(biāo)志： 1.表面受體： TCR SRBC R

18、 Fc R MR Measles viruse R,T淋巴細(xì)胞：,MHC CD,2. 表面抗原,B淋巴細(xì)胞,1. 表面受體 BCR FcR CR

19、 絲裂原受體 EBV R2. 表面抗原 MHC抗原 CD抗原（CD19、20、 21、23、45）,血淋巴細(xì)胞的分離,（一）單個(gè)核細(xì)胞的分離,密度梯度離心法,（二）純淋巴細(xì)胞的制備,1. 玻璃黏附法2. 羰基鐵粉法,（三）T、B淋巴細(xì)胞的分離,1. T細(xì)胞花環(huán)沉降法2. 尼龍毛柱分離法,（四）大顆粒

20、淋巴細(xì)胞的分離,（五）FACS儀分離（六）免疫磁珠法,三、血淋巴細(xì)胞的體外培養(yǎng)應(yīng)用,（一）淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn),（二）B細(xì)胞產(chǎn)生Ig的檢查,（三）T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒試驗(yàn),（四）NK細(xì)胞毒性試驗(yàn),（五）K細(xì)胞毒性試驗(yàn),（六）LAK細(xì)胞的制備,（七）TIL細(xì)胞的制備,（八）淋巴細(xì)胞的體外長期培養(yǎng),1. 用IL-2建立T淋巴細(xì)胞克隆2. 用EB病毒轉(zhuǎn)化B淋巴細(xì)胞3. 用B細(xì)胞生長因子建立B淋巴細(xì)胞株,腫瘤細(xì)胞體外培養(yǎng),腫瘤細(xì)胞在體外的

21、生長生物學(xué)特性,1、腫瘤細(xì)胞永生性的保持2、形態(tài)學(xué)變化3、細(xì)胞具有更高的增殖能力4、細(xì)胞表面形狀的改變5、接觸抑制減弱或消失6、懸浮生長特性7、成瘤性的特性,RPMI1640+10~20%FCS+0.03%谷氨酰胺： 上皮性癌細(xì)胞或懸浮性腫瘤細(xì)胞DMEM、199、MEM： 肉瘤細(xì)胞的培養(yǎng)F12、L-15: 上皮性癌細(xì)胞的培養(yǎng)（如肝癌細(xì)胞）

22、加: 2 g/L NaHCO3 20 mmol/L HEPES,腫瘤細(xì)胞體外培養(yǎng)常用的培養(yǎng)基,（一）培養(yǎng)液的種類和選擇,（二）培養(yǎng)液特殊添加劑,常用的促細(xì)胞生長因子及使用的終濃度 添加劑 終濃度 BSA 10-5 mol/ml TRF

23、 5~10 ug/ml Insulin 5 ug/ml 氫化可的松 10-6mol/ml EGF 5 ng/ml FGF

24、 5 ng/ml NGF 5 ng/ml,,,,腫瘤組織細(xì)胞的原代培養(yǎng)（一）取材 轉(zhuǎn)移癌標(biāo)本？ 原發(fā)癌標(biāo)本？,激光捕獲顯微切割技術(shù) Laser Captur

25、e Microdissection，LCM,組織形態(tài)學(xué)： 識別目的細(xì)胞成功捕獲細(xì)胞目的分子的完整性,原 理,目的細(xì)胞獲取：,（二）植塊培養(yǎng)法 建立細(xì)胞培養(yǎng)檔案： 病理切片、免疫組化、HE染色。 步 驟：,（

26、三）分散細(xì)胞培養(yǎng)法 1、組織細(xì)胞分離： 機(jī)械分散法 膠原酶分散法 2、 接種密度： 1×106/ml

27、 4~5ml/25cm2培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶,（四）含腫瘤細(xì)胞的體液培養(yǎng)法 (五）原代培養(yǎng)的一般結(jié)果：,成纖維細(xì)胞的生長淋巴細(xì)胞巨噬細(xì)胞上皮性癌細(xì)胞植塊周邊的細(xì)胞細(xì)胞間隙,1、刮除法2、差速黏附法3、酶消化法4、磁珠法細(xì)胞分選,（六）去除成纖維細(xì)胞的方法,1、不同培養(yǎng)方法的生長情況2、傳代：3、原代培養(yǎng)過程中避免污染和耐心操作,（七）注意事項(xiàng)：,二、腫瘤細(xì)胞的傳代,（一） 首次傳代（二）繼續(xù)傳代,腫瘤細(xì)胞的克隆

28、培養(yǎng)法,1、集落克隆法： a. 不銹鋼圈法 b. 濾紙法 c. 吸管吹打法2. 單個(gè)細(xì)胞克隆培養(yǎng)法 a. 有限稀釋法 b. 毛細(xì)管分離法 c. 蓋玻片法,腫瘤細(xì)胞體外生長的形態(tài)學(xué)與細(xì)胞學(xué)特征,1、 形態(tài)學(xué)特征：

29、 2、腫瘤細(xì)胞生長曲線和倍增時(shí)間,腫瘤細(xì)胞的核型和異常生長特性,1. 染色體數(shù)目及核型2. 永生性3. 異質(zhì)性4. 動(dòng)物接種成瘤性,細(xì)胞系的鑒定,（一）細(xì)胞系鑒定的內(nèi)容：,1、鑒定細(xì)胞系的純度2、細(xì)胞系的穩(wěn)定性3、細(xì)胞學(xué)特征4、微生物污染檢測5、染色體穩(wěn)定性6、有無細(xì)胞系（株）交叉污染,（四）細(xì)胞系的同工酶譜分析,1、用途： a、種屬來源 b、細(xì)胞特征的指

30、標(biāo) c、惡化程度的指標(biāo) d、檢測細(xì)胞系有無交叉污染 LDH G6PD NP,動(dòng)力學(xué)法 電泳區(qū)分法層析法電聚焦分離法免疫法,2、檢測方法：,已建立細(xì)胞的鑒定、管理和使用,組織起源和已傳代數(shù)凍存液細(xì)胞活力培養(yǎng)液：培養(yǎng)基、血清、抗生素等溶解后細(xì)胞生長特征接種存活率細(xì)胞形態(tài),腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)的應(yīng)用,

31、一、腫瘤細(xì)胞對組織浸潤的體外研究二、人惡性腫瘤細(xì)胞的動(dòng)物移植瘤研究三、腫瘤細(xì)胞的體外分化實(shí)驗(yàn)四、培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)研究五、腫瘤細(xì)胞的體外化療藥物敏感性實(shí)驗(yàn)六、腫瘤發(fā)病機(jī)制研究,基本思路：,腫瘤組織,腫瘤癌旁組織和正常組織,基因差異表達(dá)分析,腫瘤相關(guān)基因,基因功能研究,基因定量檢測研究,腫瘤治療靶點(diǎn),腫瘤早期診斷和治療監(jiān)測,,,,,,,SiRNA技術(shù),基因芯片技術(shù)SAGE技術(shù)（cDNA miRNA）,,,標(biāo)本處理？,

32、,基因芯片,固相芯片液相芯片,miRNA芯片 cDNA芯片甲基化芯片,,液相芯片技術(shù),實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)微量反應(yīng)體系A(chǔ)BI 7900,TaqMan® MicroRNA Arrays,,SAGE技術(shù)（serial analysis of gene expression),SAGE的原理,miRNA 檢測技術(shù)與應(yīng)用,microRNA研究現(xiàn)狀,小RNA研究—Hot topics in the world,2000年

33、，RNAi的研究進(jìn)展被Science雜志評為重大科技突破。2001年，RNAi作為當(dāng)年最重要的科學(xué)研究成果之一，再次入選“十大科技突破”。2002年12月20日，Science雜志將“Small RNA & RNAi”評為2002年度最耀眼的明星。同時(shí)，Nature雜志亦將Small RNA評為年度重大科技成果之一。2003年，microRNA的研究第四次入選“十大科技突破”，排在第四位。2005年，microRNA的研

34、究第五次入選“十大科技突破”。RNA研究的突破性進(jìn)展，是生物醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域近20年來，可與HGP相提并論的最重大成果之一。,miRNA的產(chǎn)生與功能,1.在細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)錄成前體轉(zhuǎn)錄本miRNA2.被RnaseⅢ核酸酶Drosha加工成約70- 90nt的發(fā)夾狀pre-miRNA3.轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞質(zhì)被Dicer加工成成熟miRNA4.雙鏈miRNA分子被解鏈，單鏈的miRNA 進(jìn)入一個(gè)核糖蛋白復(fù)合體miRNP(RISC)

35、5.通過與靶基因的3’ UTR 區(qū)互補(bǔ)配對，指導(dǎo) miRNP復(fù)合體對靶基因mRNA 進(jìn)行切割 或者翻譯抑制,microRNA,成熟的MicroRNA(miRNA)是一種22個(gè) nt左右的內(nèi)源性單鏈小分子RNA由帶莖環(huán)結(jié)構(gòu)的雙鏈RNA前體剪切而成具有高度保守性、時(shí)序性和組織特異性通過與特異mRNA結(jié)合，抑制目標(biāo)基因表達(dá)或降解mRNA調(diào)節(jié)人類三分之一的基因,miRNA在動(dòng)物與植物中的功能,（1）發(fā)育

36、 Timing (Lee et al. 1993) Cell proliferation (Brennecke et al. 2003) Stem cell & neuron (Krichevsky et al. 2003; Hatfield et al., 2005)（2）細(xì)胞死亡(Baehrecke, 2003) （3）疾病 腫瘤(Lu

37、 et al. 2005) 原癌miRNA(He et al. 2005) 腦腫瘤(Ciafre et al. 2005; Chan et al. 2005) 白血病(Calin et al. 2002; 2004) 糖尿病(Poy et al. 2004) （4）膽固醇的生物合成(Krutzfeldt et al. 2

38、005)（5）DNA 甲基化與染色質(zhì)修飾(Bao et al. 2004),,miRNA檢測的技術(shù)挑戰(zhàn),Northern Blot (雜交法)常規(guī)方法，易于操作需大量樣品(ug級)動(dòng)力學(xué)范圍低（約2個(gè)數(shù)量級）錯(cuò)配雜交問題，難以區(qū)分通常只有很少序列差別的序列Microarrays (芯片法)通量高可測動(dòng)力學(xué)范圍較寬需大量RNA樣品，約5μg per array 很難區(qū)分前體miRNA和成熟miRNA對類似結(jié)構(gòu)的miR

39、NA分辨率差Quantitative Real-Time PCR(實(shí)時(shí)定量PCR)只需微量樣品非常寬的動(dòng)力學(xué)范圍（7 log）高靈敏度, 高特異性,SiRNA干擾技術(shù)Small interference RNA,SiRNA技術(shù)概況,何謂 SiRNA Small interference RNA,中心法則,首先把外源的dsRNA導(dǎo)入細(xì)胞中，在細(xì)胞中，該dsRNA 被Dicer切割為21～23nt的小分子干擾核糖核酸（siR

40、NA），切割后的siRNA，然后結(jié)合到核糖核酸酶復(fù)合物上形成RNA誘導(dǎo)的基因沉默復(fù)合體（RISC），該復(fù)合體依賴ATP釋能而解聚siRNA雙鏈成單鏈以激活RISC?；罨腞ISC通過由siRNA決定的堿基互補(bǔ)配對原理切割具有同源序列的基因轉(zhuǎn)錄體，轉(zhuǎn)錄體被降解掉，最終導(dǎo)致目的基因沉默效應(yīng)。,,思考題,細(xì)胞培養(yǎng)的基本條件？體外細(xì)胞培養(yǎng)方法學(xué)和細(xì)胞生長生物學(xué)？舉一個(gè)例子，闡述上皮細(xì)胞體外培養(yǎng)技術(shù)和流程。腫瘤細(xì)胞體外培養(yǎng)技術(shù)及臨床應(yīng)