細(xì)胞培養(yǎng)基本技術(shù)

1、細(xì)胞培養(yǎng)基本技術(shù)Bin Lu, Ph. D.,http://www.nobelprize.org/,Thomas C. Südhof,Randy W. Schekman,James E. Rothman,Born: 3 November 1950, Haverhill, MA, USA,Born: 30 December 1948, St. Paul, MN, USA,Born: 22

2、 December 1955, Goettingen, Germany,Stanford University, Stanford, CA, USA,University of California, Berkeley, CA, USA,Yale University, New Haven, CT, USA,Prize motivation: "for their discoveries of machiner

3、y regulating vesicle traffic, a major transport system in our cells",1665年英國(guó)學(xué)者Robert Hooke，用自制的顯微鏡觀察軟木的薄片，第一次發(fā)現(xiàn)植物的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，并首次借用拉丁文Cella（小室）詞.1983-39德國(guó)植物學(xué)家施萊登和動(dòng)物學(xué)家施旺確立了“細(xì)胞學(xué)說(shuō)”的基本原則。（１）細(xì)胞是有機(jī)體，動(dòng)植物都是由細(xì)胞發(fā)育來(lái)的；（２）每個(gè)細(xì)胞都作為一個(gè)相

4、對(duì)的獨(dú)立單位，有自己 的“生命”。（３）新的細(xì)胞可以通過(guò)老的細(xì)胞繁殖產(chǎn)生。進(jìn)化論，遺傳學(xué)和細(xì)胞學(xué)說(shuō)定為現(xiàn)代生物學(xué)的三大基 石，而細(xì)胞學(xué)說(shuō)又是前二者的"基石"。,The cell is the basic structural and functional unit of all known living organisms. It is the smallest unit of life that

5、is classified as a living thing, and is often called the building block of life. Organisms can be classified as unicellular (consisting of a single cell; including most bacteria) or multicellular (including plants and an

6、imals). Humans contain about 10 trillion (10 ) cells. Most plant and animal cells are between 1 and 100 µm and therefore are visible only under the microscope.,13,主要內(nèi)容,一、細(xì)胞培養(yǎng)的基本概念二、細(xì)胞培養(yǎng)的基本條件三、細(xì)胞培養(yǎng)用液的配制四、細(xì)胞培養(yǎng)的基本

7、方法五、培養(yǎng)細(xì)胞活力測(cè)定六、細(xì)胞凍存和復(fù)蘇七、細(xì)胞培養(yǎng)的污染和檢測(cè),是指從體內(nèi)取出組織，分離細(xì)胞；或使用細(xì)胞系，在體外模擬體內(nèi)生理環(huán)境，在無(wú)菌、適當(dāng)溫度和一定的營(yíng)養(yǎng)條件下，使之生存和生長(zhǎng)，并維持其結(jié)構(gòu)和功能特性。,一、細(xì)胞培養(yǎng)的基本概念,細(xì)胞培養(yǎng)(cell culture)：,把活體的一小片組織（O.5～1立方毫米）置于底物上孵育，細(xì)胞自其周圍移出并生長(zhǎng)。,組織培養(yǎng) (Tissue culture)：,器官培養(yǎng) (Organ

8、culture)：,將活體中整個(gè)器官或一部分器官取出，置于生長(zhǎng)并同時(shí)保持其一定的結(jié)構(gòu)和功能特征。,細(xì)胞培養(yǎng)的基本概念,原代培養(yǎng)取自體內(nèi)新鮮組織并置于體外條件下生長(zhǎng)的細(xì)胞在傳代之前稱為原代培養(yǎng)。,優(yōu)點(diǎn)組織細(xì)胞剛脫離機(jī)體，生物性狀尚未發(fā)生較大變化，在一定程度上能夠反映體內(nèi)的狀態(tài)。,傳代,原代培養(yǎng)的細(xì)胞或細(xì)胞系，在生長(zhǎng)、繁殖一定時(shí)間后，由于空間不足或細(xì)胞密度過(guò)大，導(dǎo)致?tīng)I(yíng)養(yǎng)枯竭，會(huì)影響細(xì)胞的生長(zhǎng)，因此需要進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，即傳代或稱為傳代培養(yǎng)

9、。細(xì)胞在培養(yǎng)器皿中生長(zhǎng)一定時(shí)間后，被分開(kāi)接種到新的培養(yǎng)器皿中。,Useful Numbers for Cell CultureThere are various sizes of dishes and flasks used for cell culture. Some useful numbers such as surface area and volumes of dissociation solutions are giv

10、en below for various size culture vessels.,1The number of cells on a confluent plate, dish, or flask will vary with cell type.  For this table, HeLa cells were used.,Mammalian Cells platingCorning tech (800) 492-1

11、110 X22696 well plate 2.6 x 105 cells / well24 well plate5.4 x 104 cell/well100 mm dish 1.5 x 106 cells / dish150 mm dish4.5 x 106 cells / dish150 cm2 flask8x 106 cells = 80-90% confluent,傳代注意事

12、項(xiàng),接種數(shù)量為5×10 ～ 8×10 個(gè)/ml。 傳代密度太低，細(xì)胞容易死亡，表現(xiàn)出細(xì)胞在達(dá) 到增長(zhǎng)前有較長(zhǎng)的滯留期。 培養(yǎng)液由于pH下降而呈現(xiàn)黃色，表明細(xì)胞已經(jīng)達(dá) 到最大密度需要換液或進(jìn)行傳代培養(yǎng)。 如果是單層貼壁的細(xì)胞，等長(zhǎng)滿培養(yǎng)瓶表面，即 可進(jìn)行傳代。,4,5,原代培養(yǎng)細(xì)胞的生命歸宿,1. 原代培養(yǎng)期2. 傳代期3. 衰退期,細(xì)胞系 （ cell line ）：傳代培養(yǎng)的細(xì)胞是細(xì)

13、胞系 (原代培養(yǎng)物經(jīng)首次傳代成功后即成細(xì)胞系)。有限細(xì)胞系（ finite cell line)，無(wú)限細(xì)胞系 (infinite cell line),細(xì)胞系（cell line）,腫瘤細(xì)胞系多由瘤建成，多呈類上皮型細(xì)胞，具有不死性和異體接種致瘤性。,細(xì)胞株（ cell strain ）,由具有某些特性與標(biāo)志的細(xì)胞，經(jīng)選擇或克隆化而派生的亞系，這些特性或標(biāo)志在后續(xù)的培養(yǎng)中一直保持下去的細(xì)胞群。 再由原細(xì)胞株進(jìn)一步分離培養(yǎng)

14、出與原株性狀不同的細(xì)胞群，亦可稱之為亞株。,細(xì)胞系或細(xì)胞株的命名,以供體患者的姓名命名： HeLa （來(lái)源于宮頸癌）以時(shí)間地點(diǎn)來(lái)命名： CHO 中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞 （Chinese Hamster Ovary ） 宮-743： 宮頸癌上皮細(xì)胞，1974年3月建立 NIH3T3：美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院（National Institute of Health）建立，

15、 每3天傳代，每次接種3×105細(xì)胞／ml以組織來(lái)源命名：如BHK(幼地鼠腎細(xì)胞) 以臨床疾病類型命名：如BALL-1細(xì)胞系(來(lái)自B淋巴細(xì)胞急性白血病人白細(xì)胞),二、細(xì)胞培養(yǎng)的基本條件,無(wú)菌條件細(xì)胞生長(zhǎng)條件細(xì)胞檢測(cè)條件細(xì)胞保存條件實(shí)驗(yàn)室安全,細(xì)胞培養(yǎng)的無(wú)菌環(huán)境,無(wú)菌室的結(jié)構(gòu)：一般由更衣間、緩沖間、操作間三部分組成。 （使用前）紫外照射（15-30分鐘）每周甲醛熏蒸（

16、2小時(shí)）和每月新潔爾滅擦拭地面一次的方式進(jìn)行消毒,超凈工作臺(tái),超凈工作臺(tái)的工作原理是利用鼓風(fēng)機(jī)驅(qū)動(dòng)空氣遁過(guò)高效濾器除去空氣中的塵埃顆粒，使空氣得到凈化。凈化空氣徐徐通過(guò)工作臺(tái)面，使工作臺(tái)內(nèi)構(gòu)成無(wú)菌環(huán)境。,超凈工作臺(tái)的使用,使用前 開(kāi)啟柜內(nèi)紫外燈照射10－30分鐘； 預(yù)工作10－15分鐘，以除去臭氧和使工作臺(tái)面、空間呈凈化狀態(tài)。使用完畢后 要用70%酒精將臺(tái)面和臺(tái)內(nèi)四周擦拭干凈。,火焰消毒,在無(wú)菌環(huán)境進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，首先要點(diǎn)燃酒

17、精燈。以后一切操作，如打開(kāi)或封閉瓶口等，都需在火焰近處并經(jīng)過(guò)燒灼進(jìn)行。培養(yǎng)瓶滴管、試管、吸管,常用培養(yǎng)器皿的清洗及消毒,玻璃器皿的清洗 一般經(jīng)過(guò)浸泡（自來(lái)水）、刷洗（洗衣粉）、酸泡（24小時(shí)）、和清洗（流水沖洗和蒸溜水沖洗）四個(gè)步驟，然后50℃烘干。 新的橡膠制品洗滌方法 0.5M NaOH煮沸15分鐘，流水沖洗，0.5M HCl煮沸15分鐘，流水沖洗，自來(lái)水煮沸2次，蒸餾水煮沸20分鐘，50℃烤干備用。,,*,清

18、潔液的配制,消毒,壓力蒸汽消毒器：濕熱消毒，15磅，維持20-30分鐘。 消毒前常用的包裝材料：牛皮紙、棉布、鋁飯盒電熱干燥箱：干熱消毒，160℃～180℃，維持2小時(shí)。 主要用于玻璃器皿消毒。,細(xì)胞培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)用品,細(xì)胞培養(yǎng)瓶 (Flask)25平方厘米 （T25)75平方厘米 (T75)150平方厘米 (T150),細(xì)胞培養(yǎng)板 (Plate) 6孔12孔24孔48孔96

19、孔,細(xì)胞培養(yǎng)皿 (Dish) 35 mm60 mm 100 mm150 mm,凍存管Cryo Vial 1.2ml 2ml5ml,離心管 15ml 50ml細(xì)胞刮,濾 器,大多數(shù)培養(yǎng)用液，如人工合成培養(yǎng)基、血清、酶液等均采用濾過(guò)法除菌。安裝濾膜時(shí)注意：濾膜光滑一面是正面，要朝上，否則起不到過(guò)濾的作用。,CO2培養(yǎng)箱,CO2培養(yǎng)箱設(shè)定的條件為37 ℃ ，5％ CO2

20、 。使用CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)應(yīng)注意的問(wèn)題：①用螺旋口瓶培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)，需將瓶蓋微 松，以保證通氣。 ②保持培養(yǎng)箱內(nèi)空氣干凈。定期消毒。③ 箱內(nèi)滅菌蒸餾水3000毫升蒸餾水槽中以保持箱內(nèi)濕度，避兔培養(yǎng)液蒸發(fā)。,培養(yǎng)細(xì)胞的觀察,液氮罐,何處購(gòu)買細(xì)胞,ATCC 細(xì)胞庫(kù)(www.atcc.org). 美國(guó)菌種保藏中心又稱美國(guó)模式菌種收集中心。目前它可以提供以下物品 細(xì)胞系3000種 細(xì)菌和噬菌體 150

21、00種 動(dòng)植物病毒 2500種 原生動(dòng)物 1200種以及重組物品 歐洲動(dòng)物細(xì)胞庫(kù)(ECACC)和日本細(xì)胞庫(kù)(RCB),國(guó)內(nèi)細(xì)胞庫(kù),中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù) 中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心 也稱武漢大學(xué)保藏中心，是國(guó)家知識(shí)產(chǎn)權(quán)局指定的專利培養(yǎng)物/生物材料／菌種保藏機(jī)構(gòu)。http://sub.whu.edu.cn/cctcc/fzlbc/pywml.htm,培養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)的條件,1

22、 細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)需要2 細(xì)胞的生存環(huán)境 溫度: 37 ℃ O2 CO2: 5% CO2 +H2O ← →H2CO3 ← →H+ + HCO3- pH: 7.2-7.4 滲透壓 3 無(wú)污染 4 無(wú)毒,細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng),碳水化合物、氨基酸和脂類三大類也需要一定量的無(wú)機(jī)鹽、維生素和微量元素,細(xì)胞培養(yǎng)的常用液體,水平衡鹽溶液 pH調(diào)節(jié)液消化液抗生素溶液培養(yǎng)基,,,三、細(xì)胞培養(yǎng)用液的配制,水：新鮮的三蒸水或

23、去離子水平衡鹽溶液 主要由無(wú)機(jī)鹽和葡萄糖配制而成 作用：維持滲透壓、緩沖和調(diào)節(jié)酸堿度 常用的緩沖液： 生理鹽水 PBS Hanks液 （D-Hank’s常用于配制胰酶溶液）,平衡鹽溶液：無(wú)Ca2+、Mg2+的緩沖液 PBS：NaCl 8.0 g

24、 KCl 0.2 g Na2HPO4.H2O 1.56 g KH2PO4 0.20 加水至1000 ml D-Hank’s液,pH調(diào)節(jié)液,碳酸氫鈉液 HEPE

25、S緩沖液 是一種氫離子緩沖劑，能在細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中較長(zhǎng)時(shí)間保持恒定的pH范圍。 通常使用濃度為10～15mM，一般培養(yǎng)液內(nèi)含20mmol/LHEPES即可達(dá)到緩沖能力。,消化液,胰蛋白酶溶液EDTA溶液 膠原酶溶液,胰蛋白酶溶液,主要作用： 水解與賴氨酸或精氨酸相連接的肽鍵，除去細(xì)胞間粘蛋白及糖蛋白，使貼壁細(xì)胞從瓶壁上脫落并使細(xì)胞分離。常用濃度：0.25% 用無(wú)Ca2+、Mg2+的PBS緩沖液或D-Hank’s

26、配制，用濾器過(guò)濾除菌。消化時(shí)間：2-10分鐘（顯微鏡下觀察） 用含血清培養(yǎng)液終止其對(duì)細(xì)胞的消化作用。,EDTA溶液,作用機(jī)制： 通過(guò)結(jié)合（螯合）細(xì)胞間質(zhì)中的二價(jià)陽(yáng)離子，從而破壞細(xì)胞間的連接。使用濃度： 0.02%，配制時(shí)應(yīng)加堿助溶。 EDTA不能被血清中和，終止消化后，需用培養(yǎng)液或PBS徹底沖洗培養(yǎng)瓶。,膠原酶溶液,主要作用 水解結(jié)締組織中膠原蛋白成分，而對(duì)上皮細(xì)胞影響不大。常用劑量：

27、 最終濃度200U/ml（約為1mg/mL）或0.03%~0.3%，可用 D-hanks、PBS或含血清的培養(yǎng)液配制。分型： 分Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ型以及肝細(xì)胞專用膠原酶，根據(jù) 所要分離消化的組織類型選擇膠原酶類型（價(jià)格貴）。,胰蛋白酶和膠原酶生物活性的差別,項(xiàng)目 胰蛋白酶 膠原酶 消化特性 消化軟組織 消化纖維多的組織 用

28、量 0.01%~0.5% 0.1~0.3 mg/mL（200 U/mL） 消化時(shí)間 0.5 ~ 2h 1 ~ 12h pH 8~9 6.5~7.0 作用強(qiáng)度 強(qiáng)烈 緩和 細(xì)胞影響 時(shí)間過(guò)長(zhǎng)有影響 無(wú)大影響 血清抑活 有

29、 無(wú) Ca2+和Mg2+ 有影響 無(wú)影響,,,,抗生素溶液,通常是青霉素和鏈霉素聯(lián)合使用，俗稱“雙抗溶液”。配制 具體操作均在超凈臺(tái)內(nèi)完成。青霉素是80萬(wàn)U/瓶，用注射器加4ml滅菌雙蒸水。鏈霉素是100萬(wàn)U/瓶，加5ml滅菌雙蒸水，即每毫升各為20萬(wàn)U。 使用時(shí)溶入培養(yǎng)液中，使青、鏈霉素的濃度最終為100U/ml。慶大霉素：使用終濃度為100U/ml，廣譜、穩(wěn)定

30、。,培養(yǎng)基,培養(yǎng)基（培養(yǎng)液）是維持體外細(xì)胞生存和生長(zhǎng)的溶液，分天然培養(yǎng)基和合成培養(yǎng)基。天然培養(yǎng)基：天然培養(yǎng)基有血清、血漿、和組織提取液（如雞胚和牛胚浸液）。優(yōu)點(diǎn)：營(yíng)養(yǎng)成分豐富，培養(yǎng)效果好缺點(diǎn)：來(lái)源受限。成分復(fù)雜，影響對(duì)某些實(shí)驗(yàn)產(chǎn)物的提取和實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析。易發(fā)生支原體污染,合成培養(yǎng)基,,,根據(jù)細(xì)胞生存所需物質(zhì)的種類和數(shù)量，用人工方法模擬合成的。包括四大類物質(zhì)：無(wú)機(jī)鹽、氨基酸、維生素、碳水化合物目前常用培養(yǎng)基：RPMI-164

31、0、DMEM、TC199、M199、MEM另有無(wú)血清培養(yǎng)基、無(wú)蛋白培養(yǎng)基人工合成培養(yǎng)基只能維持細(xì)胞生存，要想使細(xì)胞生長(zhǎng)和繁殖，還需補(bǔ)充一定量的天然培養(yǎng)基（如血清）。,優(yōu)點(diǎn)：標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)，組分和含量相對(duì)固定。成本低 缺點(diǎn)： 缺少某些成分，不能完全滿足體外細(xì)胞生長(zhǎng)需要。,RPMI1640,最初是由G.E，Moore為培養(yǎng)小鼠白血病細(xì)胞而設(shè)計(jì)的。開(kāi)始的配方特別適合于懸浮細(xì)胞生長(zhǎng)，主要針對(duì)淋巴細(xì)胞，后經(jīng)過(guò)改良，從RPMI1630、RPMI

32、1634、直至RPMI1640。其組分較為簡(jiǎn)單，適合許多種細(xì)胞，如腫瘤細(xì)胞、正常細(xì)胞、原代培養(yǎng)、傳代培養(yǎng)等。尤其適合人白細(xì)胞，如H9、T-15、HL-60、IM-9和K-562 等細(xì)胞系的培養(yǎng)。,RPMI1640種類,RPMI—1640（A） （不含谷氨酰胺、可高壓滅菌）RPMI—1640 （含谷氨酰胺、過(guò)濾滅菌）,DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基,是在MEM培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上研制的與MEM比較增加了各種成分用量，同時(shí)又分為高糖型（4500

33、g/L）和低糖型(1000g/L)。高糖型有利于細(xì)胞停泊于一個(gè)位置生長(zhǎng)，適于生長(zhǎng)較快、附著較困難的腫瘤細(xì)胞等。  DMEM（A）【不含谷氨酰胺、可高壓滅菌】 DMEM（H）【含谷氨酰胺、高糖型、除菌過(guò)濾滅菌】 DMEM（L）【含谷氨酰胺、低糖型、除菌過(guò)濾滅菌】,血清的使用,血清質(zhì)量好壞是實(shí)驗(yàn)成敗的關(guān)鍵常用血清 胎牛血清、新生牛血清、小牛血清、兔血清、 馬血清等，胎牛血清是品質(zhì)最高的

34、。優(yōu)質(zhì)血清的標(biāo)準(zhǔn) 透明，淡黃色，無(wú)沉淀物，無(wú)細(xì)菌、支原體、 病毒污染。血清的滅活（消除補(bǔ)體活性） 56℃ ，30 分鐘。血清的消毒：過(guò)濾除菌,牛血清,胎牛血清應(yīng)取自剖腹產(chǎn)的胎牛新生牛血清取自出生24小時(shí)之內(nèi)的新生牛小牛血清取自出生10～30天的小牛使用濃度： 一般為5～20％，最常用是10％。,何謂FBS、FCS、 CS、HS?,FBS (fetal bovine serum) 和FCS (f

35、etal calf serum) 是相同的意思， 兩者都是指胎牛血清， FCS乃錯(cuò)誤的使用字眼， 請(qǐng)不要再使用。CS (calf serum) 是指小牛血清HS (horse serum) 是指馬血清,胎牛血清（Fetal Bovine Serum ,FBS）: 屠宰懷孕母牛的時(shí)候,通過(guò)心臟穿刺采血獲取的胎牛的血清，新生牛（小牛）血清（Calf serum, CS）則采自出生10至14 天的小牛。

36、兩者所含的促細(xì)胞生長(zhǎng)因子、促貼附因子、激素及其他活性物質(zhì)等組份與比例不同。用途與用法也有所區(qū)別，比如某些細(xì)胞必需胎牛血清才能生長(zhǎng)，而有些細(xì)胞只需小牛血清即可。一般來(lái)說(shuō)，胎牛血清是品質(zhì)最高的，因?yàn)樘ヅ＿€未接觸外界，血清中所含的抗體、補(bǔ)體等對(duì)細(xì)胞有害的成分最好。除了用于細(xì)胞培養(yǎng)外，這些牛血清還可用于封閉液、保護(hù)液和緩沖液等。,血清解凍步驟,逐步解凍法 –30℃ 或–80℃至4℃冰箱溶解一天，至室溫下全溶后再分裝，一般用50 ml無(wú)菌

37、離心管可分裝40～45 ml。勿直接由–30℃至37℃解凍，因溫度改變太大，容易造成蛋白質(zhì)凝結(jié)而發(fā)生沉淀。,無(wú)機(jī)鹽,CaCl2 、KCl 、MgSO4、 NaCl 、NaHCO3 、NaH2PO4對(duì)調(diào)節(jié)細(xì)胞滲透壓、某些酶的活性及溶液的酸堿度都是必須的。,谷氨酰胺,細(xì)胞需要谷氨酰胺合成核酸和蛋白質(zhì)，谷氨酰胺缺乏要導(dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)不良甚至死亡。一般培養(yǎng)液中谷氨酰胺的含量為1～4mmol/L。谷氨酰胺在溶液中很不穩(wěn)定，4℃放置1周可分解

38、50％，故應(yīng)單獨(dú)配制，置于-20℃保存，臨用前加入培養(yǎng)液。配制方法：谷氨酰胺2.922g溶于三蒸水加至100ml即配成200mmol/L的溶液，充分?jǐn)嚢枞芙夂?，過(guò)濾除菌，分裝小瓶，-20℃保存，使用時(shí)可向100ml培養(yǎng)液中加入1ml谷氨酰胺溶液。谷氨酰胺雙肽，如甘氨?；劝滨０?。這種谷氨酰胺在溶液中穩(wěn)定，并可與谷氨酰胺一樣有效地被細(xì)胞利用。,水：新鮮配置的三蒸水或去離子水平衡鹽溶液：無(wú)Ca2+、Mg2+的緩沖液

39、PBS： NaCl 8.0 g KCl 0.2 g Na2HPO4.H2O 1.56 g KH2PO4 0.20 加新鮮配置的三蒸水或

40、去離子水 至1000 ml,,細(xì)胞培養(yǎng)用液的配制,人工合成培養(yǎng)基只能維持細(xì)胞生存，要想使細(xì)胞生長(zhǎng)和繁殖，還需補(bǔ)充一定量的天然培養(yǎng)基（如血清）。,血清中含有：①多種蛋白質(zhì)（白蛋白、球蛋白、鐵蛋白等）②多種金屬離子； ③激素；④促貼附物質(zhì)，如纖粘蛋白、冷析球蛋白、膠原等。⑤各種生長(zhǎng)因子⑥轉(zhuǎn)移蛋白⑦不明成分 (like UFO),完全培養(yǎng)基的組成,基礎(chǔ)培養(yǎng)基

41、 80％一95％血清 5％一20％碳酸氫鈉 2.0 g/L青、鏈霉素 各100卑位／毫升,一般說(shuō)來(lái)．含5％小牛血清的培養(yǎng)基對(duì)大多數(shù)細(xì)胞可以維持細(xì)胞不死．但支持細(xì)胞生長(zhǎng)一般需加 10％血清．對(duì)于血清支持細(xì)因生長(zhǎng)的生物學(xué)效應(yīng)已得到證明，但對(duì)血清中的復(fù)雜成分至

42、今尚未完全清楚．血清中不僅存在促細(xì)胞生長(zhǎng)因子，同對(duì)也存在細(xì)胞生長(zhǎng)抑制因子或毒性因子，因此在含血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)的細(xì)胞所反映的生物學(xué)特性是細(xì)胞和復(fù)雜血清因子的綜合反應(yīng)。在生長(zhǎng)因子、蛋白質(zhì)工程、基因表達(dá)調(diào)控等研究領(lǐng)域，迫切需要用無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞．,培養(yǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)方式及類型㈠ 貼附生長(zhǎng)型細(xì)胞 必須貼附于底物才能生長(zhǎng)的細(xì)胞。從形態(tài)上大體分為上皮細(xì)胞型及成纖維細(xì)胞型，還有一些難以確定其穩(wěn)定形態(tài)的細(xì)胞。㈡ 懸浮生長(zhǎng)型細(xì)胞

43、 不需要附著于底物而于懸浮狀態(tài)下即可生長(zhǎng)。見(jiàn)于各種造血系統(tǒng)腫瘤細(xì)胞,四、細(xì)胞培養(yǎng)的基本方法,細(xì)胞的貼附過(guò)程,㈠ 貼附生長(zhǎng)型細(xì)胞,,,,,,,,,,,,,,,,,,,+ + + + + + +,,,,,,,+ + + + +,,,,,,,,,,,貼附物質(zhì)帶正電荷,細(xì)胞帶負(fù)電荷,,,,上皮樣細(xì)胞,來(lái)源：來(lái)源于外胚層，內(nèi)胚層細(xì)胞 如：皮膚及其衍生物

44、 消化道，乳腺，肺泡 上皮性腫瘤形態(tài)：類似體內(nèi)的上皮細(xì)胞 扁平，不規(guī)則多角形，中有圓形核,,,,,生長(zhǎng)特點(diǎn) 易相連成片 相靠—緊密相連—成薄層—鋪石狀 生長(zhǎng)時(shí)呈膜狀移動(dòng) 很少脫離細(xì)胞群而單個(gè)活動(dòng),上皮型細(xì)胞,SKOv3（卵巢癌細(xì)胞）1.細(xì)胞種類：SKOv3（卵巢癌細(xì)胞）

45、2.培養(yǎng)的天數(shù)：傳代后3d；3.放大倍速：倒置顯微鏡 X10；4.培養(yǎng)基種類：DMEM+5%胎牛血清；5.細(xì)胞狀態(tài)與特征簡(jiǎn)述：細(xì)胞貼壁生 長(zhǎng)，生長(zhǎng)速度較快。,CCL-1491.細(xì)胞種類：大鼠肺泡上皮細(xì)胞；2.培養(yǎng)的天數(shù)：1d（種在48孔板中）；3.放大倍速：倒置顯微鏡 X20；4.培養(yǎng)基種類：F12K+10%胎牛血清；5.細(xì)胞狀態(tài)與特征簡(jiǎn)述：細(xì)胞呈梭形，透亮貼壁生長(zhǎng)，3－4天傳代一次，Giemsa染色。,成

46、纖維細(xì)胞樣細(xì)胞,來(lái)源：由中胚層間充質(zhì)組織起源的組織 如：真正的成纖維細(xì)胞 心肌，平滑肌，成骨細(xì)胞，內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)：似體內(nèi)成纖維細(xì)胞的形態(tài) 胞體梭形或不規(guī)則三角形 胞質(zhì)向外伸出2—3個(gè)長(zhǎng)短不等的突起 中有卵圓形核,,,,,生長(zhǎng)特點(diǎn) 排列成放射狀，漩渦狀 并不緊靠連成片，

47、 細(xì)胞—細(xì)胞接觸易斷開(kāi)而 單獨(dú)行動(dòng) 游離的單獨(dú)的成纖維樣細(xì)胞， 常有幾個(gè)伸長(zhǎng)的細(xì)胞突起,HUVECs人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞1.細(xì)胞種類：人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞；2.培養(yǎng)的天數(shù)：4d；原代培養(yǎng)；3.放大倍速：倒置顯微鏡 X20；4.培養(yǎng)基種類：M199+15％胎牛 血清；5.細(xì)胞狀態(tài)與特征簡(jiǎn)述：細(xì)胞呈梭 形，扁平形或多角形，貼壁生長(zhǎng)。,骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞1.細(xì)胞種類：人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞原代

48、；2.培養(yǎng)天數(shù)：7天；3.放大倍數(shù)：200倍，倒置顯微鏡；4.培養(yǎng)基種類：DF12+10％FBS；5.細(xì)胞狀態(tài)與特征簡(jiǎn)述：使用percoll密度梯度離心法分離人骨髓細(xì)胞。首次換液48h，這是7天后的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞擴(kuò)增情況。,每代貼壁細(xì)胞的生長(zhǎng)過(guò)程,游離期貼壁期潛伏期對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期停止期（平臺(tái)期）,游離期細(xì)胞接種后在培養(yǎng)液中呈懸浮 狀態(tài)．也稱懸浮期。此時(shí)細(xì)胞質(zhì)回縮，胞體呈圓球形。10分鐘一4小時(shí)懸浮，胞質(zhì)回縮，全部細(xì)胞變

49、為圓球形。吸附期 貼附底物，一般24小時(shí)內(nèi)貼壁。潛伏期 此時(shí)細(xì)胞有生長(zhǎng)活動(dòng)，基本無(wú)增殖。 細(xì)胞株潛伏期一般為6～24小時(shí)。對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期 細(xì)胞數(shù)隨時(shí)間變化成倍增長(zhǎng)，活力最佳，最適合進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究。停止期（平臺(tái)期） 細(xì)胞長(zhǎng)滿瓶壁后，細(xì)胞雖有活力但不再分裂。 機(jī)制：接觸抑制、密度依賴性,密度抑制（Density inhibition）或接觸抑制（Ccontact inhibition）,

50、1958年Abercrombie 等學(xué)者提出的一種現(xiàn)象，培養(yǎng)細(xì)胞再生長(zhǎng)過(guò)程中多發(fā)生分裂增殖，細(xì)胞移動(dòng)而相互靠近，這時(shí)某些細(xì)胞可移向其他方向，保證細(xì)胞不會(huì)重疊，一但接觸，這種活動(dòng)即可停止。所謂接觸抑制實(shí)際使細(xì)胞匯合形成單層時(shí)，細(xì)胞變得擁擠，與培養(yǎng)液接觸的表面區(qū)域也相應(yīng)減少，營(yíng)養(yǎng)成分消耗，其分裂也將停止。,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,懸浮生長(zhǎng)型細(xì)胞,來(lái)源：血，脾或骨髓，尤以血中白細(xì)胞腫瘤細(xì)胞特點(diǎn)：在懸浮中生長(zhǎng)良好的細(xì)胞

51、，圓形優(yōu)點(diǎn)：生存空間大，提供數(shù)量大， 傳代方便，易于收獲，可獲 得穩(wěn)定狀態(tài)缺點(diǎn)：觀察不方便，很多細(xì)胞不能 懸浮生長(zhǎng)(尤以正常細(xì)胞),KU8121.細(xì)胞種類：人嗜堿細(xì)胞性白血病細(xì)胞系；2.培養(yǎng)的天數(shù)：5d；3.放大倍速：倒置顯微鏡 X20；4.培養(yǎng)基種類：RPMI1640+10%新生牛血清；5.細(xì)胞狀態(tài)與特征簡(jiǎn)述：細(xì)胞呈圓形，懸浮生長(zhǎng)。,K562細(xì)胞1.細(xì)胞種類：K562（人慢性紅白

52、血病細(xì)胞株）；2.培養(yǎng)的天數(shù)：傳代后2天；3.放大倍數(shù)：倒置顯微鏡 X10；4.培養(yǎng)基種類：RPMI1640+10%胎牛血清，4mM Glutamine；5.細(xì)胞狀態(tài)與特征簡(jiǎn)介：懸浮生長(zhǎng)，少數(shù)貼壁，喜愛(ài)成團(tuán)懸浮。,1．懸浮生長(zhǎng)細(xì)胞傳代,細(xì)胞傳代方法,直接傳代即讓懸浮細(xì)胞慢慢沉淀在瓶底后，將上清洗掉1/2 ~ 1/3，然后用吸管吹打形成細(xì)胞懸液后，再傳代。離心法：離心800 ~ 1000rpm，5min，除上清，加新的培養(yǎng)液，然

53、后傳代接種。部分貼壁生長(zhǎng)細(xì)胞直接吹打傳代或需消化后傳代,直接傳代即讓懸浮細(xì)胞慢慢沉淀在瓶底后，將上清洗掉1/2 ~ 1/3，然后用吸管吹打形成細(xì)胞懸液后，再傳代。離心法：離心800 ~ 1000rpm，5min，除上清，加新的培養(yǎng)液，然后傳代接種。部分貼壁生長(zhǎng)細(xì)胞直接吹打傳代或需消化后傳代,吸除瓶?jī)?nèi)舊培養(yǎng)液；加入1ml消化液；37C或室溫25 C消化2 ~ 5分鐘顯微鏡下進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)胞質(zhì)回縮、細(xì)胞間隙增大后；直接加少許含血清

54、的培養(yǎng)液，終止消化；細(xì)胞脫離瓶壁后形成細(xì)胞懸液計(jì)數(shù)，分別接種在新的培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)。,2．貼壁生長(zhǎng)細(xì)胞傳代 采用酶消化法傳代。 常用的消化液是0.25％的胰蛋白酶液。,首次傳代注意事項(xiàng),細(xì)胞生長(zhǎng)密度不高時(shí)，不能急于傳代 原代培養(yǎng)的貼壁細(xì)胞需控制消化時(shí)間 吹打已消化的細(xì)胞應(yīng)減少機(jī)械損傷 首次傳代時(shí)細(xì)胞接種數(shù)量要多一些 首次傳代培養(yǎng)的pH應(yīng)偏低些 小牛血清濃度可加大至15%～20%左右,細(xì)胞計(jì)數(shù),計(jì)數(shù)結(jié)果以每毫升細(xì)胞數(shù)表示

55、細(xì)胞計(jì)數(shù)的原理和方法與血細(xì)胞計(jì)數(shù)相同血細(xì)胞計(jì)數(shù)器：手工計(jì)數(shù)細(xì)胞Coulter計(jì)數(shù)儀：人工計(jì)數(shù),細(xì)胞計(jì)數(shù)步驟,1、將血球計(jì)數(shù)板及蓋片擦拭干凈，并將蓋片蓋在計(jì)數(shù)板上。2、將細(xì)胞懸液吸出少許，滴加在蓋片邊緣，使懸液充滿蓋片和計(jì)數(shù)板之間?！?、靜置3分鐘。4、鏡下觀察，計(jì)算計(jì)數(shù)板四大格細(xì)胞總數(shù)。　　細(xì)胞數(shù)/ml＝4大格細(xì)胞總數(shù)/ 4×104注意：壓線細(xì)胞只計(jì)左側(cè)和上方的。 鏡下偶見(jiàn)由兩個(gè)以上細(xì)胞組成的細(xì)胞團(tuán)

56、，應(yīng)按單個(gè)細(xì)胞計(jì)算，若細(xì)胞團(tuán)占10%以上，說(shuō)明分散不好，需重新制備細(xì)胞懸液。,五、培養(yǎng)細(xì)胞活力測(cè)定,細(xì)胞活力： 總細(xì)胞中活細(xì)胞所占的百分比。由組織中分離細(xì)胞一般也要檢查活力，以了解分離的過(guò)程對(duì)細(xì)胞是否有損傷作用。復(fù)蘇后的細(xì)胞也要檢查活力，了解凍存和復(fù)蘇的效果。,測(cè)定方法,臺(tái)盼藍(lán)法 活細(xì)胞不被染色，死細(xì)胞染成藍(lán)色。流式細(xì)胞儀 細(xì)胞活性指標(biāo)通常包括細(xì)胞膜對(duì)核酸染料的通透性，代謝活性，膜電位等。,四唑鹽（MTT）比色法MT

57、T比色法的原理： 活細(xì)胞中琥珀脫氫酶能將四唑鹽還原成不溶干水的藍(lán)紫色產(chǎn)物甲臢（formazan)，并沉淀在細(xì)胞中，而死細(xì)胞沒(méi)有這種功能。 二甲亞砜（DMSO）能溶解沉積在細(xì)胞中藍(lán)紫色結(jié)晶物，溶液顏色深淺與所含的formazan量成正比。 甲臢染料在A570nm處產(chǎn)生吸收值，用酶標(biāo)儀測(cè)定A值。,,六、細(xì)胞凍存和復(fù)蘇,細(xì)胞深低溫保存的基本原理是： 在－80℃以下時(shí)，細(xì)胞內(nèi)的酶活性均己停止，即代謝處

58、于完全停止?fàn)顟B(tài)，故可以長(zhǎng)期保存。細(xì)胞低溫保存的關(guān)鍵： 在于通過(guò)0~-20℃階段的處理過(guò)程。在此溫度范圍內(nèi)，水晶呈針狀，極易招致細(xì)胞的嚴(yán)重?fù)p傷。,凍存和復(fù)蘇的原則：慢凍快融,當(dāng)細(xì)胞冷到零度以下，可以產(chǎn)生以下變化：細(xì)胞器脫水，細(xì)胞中可溶性物質(zhì)濃度升高，并在細(xì)胞內(nèi)形成冰晶。 如果緩慢冷凍，可使細(xì)胞逐步脫水，細(xì)胞內(nèi)不致產(chǎn)生大的冰晶；相反．結(jié)晶就大，大結(jié)晶會(huì)造成細(xì)胞膜、細(xì)胞器的損傷和破裂。復(fù)蘇過(guò)程應(yīng)快融，目的是防

59、止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重結(jié)晶。,慢凍程序 4 ℃ 10 分鐘 －20 ℃ 30 分鐘 －80 ℃ 16 - 18 小時(shí)(或隔夜) 液氮罐長(zhǎng)期儲(chǔ)存。,細(xì)胞復(fù)蘇方法,（1）從液氮中取出冷凍管，迅速投入37 ℃ ～ 38℃水浴中，使其融化（1分鐘左右）；（2）5分鐘內(nèi)用培養(yǎng)液稀釋至原體積的10倍以上；（3）低速離心10分鐘；（4）去上清，加新鮮培養(yǎng)液培養(yǎng)剛復(fù)蘇的細(xì)胞。,低

60、溫保護(hù)劑的應(yīng)用,在細(xì)胞凍存時(shí)加入低溫保護(hù)劑，能大大提高凍存效果。常用的低溫保護(hù)劑是DMSO，它是一種滲透性保護(hù)劑。凍存液： 含20%血清培養(yǎng)基和10% DMSO（或10％甘油） DMSO液用培養(yǎng)液配好，避免因臨時(shí)配制產(chǎn)熱而傷害細(xì) 胞。,細(xì)胞欲冷凍保存時(shí)，細(xì)胞濃度應(yīng)該多少？,冷凍管內(nèi)細(xì)胞數(shù)目一般為1x106 cells/ml 融合瘤細(xì)胞則以5x106 cells/ml 為宜。,七、細(xì)胞培養(yǎng)的污染和檢測(cè),細(xì)胞污染的

61、種類 細(xì)菌、真菌、酵母菌、霉菌和病毒污染源 無(wú)菌操作技術(shù)不當(dāng) 操作室環(huán)境不佳 污染之血清 污染之細(xì)胞,細(xì)菌污染,細(xì)胞培養(yǎng)常見(jiàn)的污染最常見(jiàn)的有：大腸桿菌、枯草桿菌、假單胞菌、白色葡萄球菌。 培養(yǎng)細(xì)胞受細(xì)菌污染后，會(huì)出現(xiàn)培養(yǎng)液變混濁，pH改變。污染后細(xì)胞發(fā)生病理改變，胞內(nèi)顆粒增多、增粗，最后變圓脫落死亡。,真菌污染,真菌污染后，細(xì)胞生長(zhǎng)變慢，但最后由于營(yíng)養(yǎng)耗盡及毒性作用而使細(xì)胞脫落死亡。,細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)液仍清

62、亮但變黃，細(xì)胞生長(zhǎng)變緩，部分細(xì)胞發(fā)生脫落，細(xì)胞間隙可見(jiàn)鋪滿細(xì)沙樣小點(diǎn)。,支原體污染表現(xiàn),熒光染料Hoechst33258染色法檢測(cè)支原體,支原體污染電鏡照片, 煎蛋狀和其他形狀,白色念珠菌污染,Concentrating Cells,ProtocolTo concentrate cells from a suspension culture (or resuspended cells from monolayer culture):

63、 Transfer the cell suspension to a sterile centrifuge tube of appropriate size and centrifuge for 10 minutes at 800 × g.Note:  Certain cell lines are very sensitive to centrifugal force.Carefully remov

64、e the supernatant without disturbing the cell pellet. Add the desired volume of fresh medium gently to the side of the tube and slowly pipette up and down 2 to 3 times to resuspend the cell pellet. Transfer