細(xì)胞培養(yǎng)學(xué)筆記(4)

1、細(xì)胞培養(yǎng)學(xué)筆記（4）一、細(xì)胞一般形態(tài)學(xué)觀察法1.細(xì)胞固定方法:(1)甲醇醋酸(3:1):甲醇穿透力好易于揮發(fā)醋酸固定蛋白效果好可使細(xì)胞膨脹結(jié)合使用能維持細(xì)胞形態(tài)不變用于觀察染色體.(2)FAA固定液:(80%酒精90ml冰醋酸5m1中性福爾馬林(用時(shí)向瓶中加過量MgCO3中和)5ml.)用于蓋片單層培養(yǎng).(3)Carnoy(純酒精60ml氯仿30ml冰醋酸10ml):是非水溶性固定液穿透力差適用于顯示細(xì)胞化學(xué)成分等方法對(duì)固定培養(yǎng)單層細(xì)胞

2、效果非常好.2.一般染色法:Giemsa染色法:(1)Giemsa粉0.5g甘油22ml研磨(2)56℃保溫2小時(shí)后加入33ml純甲醉保存(3)pH6.87.38的磷酸鹽緩沖液按1:9比例稀釋染液(4)甲醇固定10min或醋酸甲醇固定30min染色(5)染1015min自來水沖干燥二甲苯透化樹脂膠封.胞核染成紫紅色或藍(lán)紫色胞漿染成粉紅色.蘇木精伊紅染色法:(1)37℃溫BSS洗3次20s1min中性福爾馬林固定3min(2)蒸餾水洗1次

3、再用稀釋的蘇木精液(120)染10min(3)水洗置入1%NaHCO3液中漂洗至藍(lán)紫色(4)伊紅水溶液中染30s1min(5)蒸餾水洗迅速通過丙酮2次每次35min(6)通過2:1丙酮二甲苯3次每次12min(7)通過1:2丙酮二甲苯3次.每次12min(8)純二甲苯510min(9)把蓋片置載物玻片上用樹膠封存再覆以較大蓋片.Feulgen染色法:鑒別細(xì)胞中DNA的組織化學(xué)方法.細(xì)胞中的DNA在60℃用1MHC1酸解離脫氧核糖核酸使嘌

4、呤堿基與糖苷鍵破壞嘌呤堿脫掉脫氧核糖中的醛基游離醛基能與Schiff試劑相結(jié)合形成一種紫色的復(fù)合物.(1)單層蓋片法培養(yǎng)細(xì)胞Carnoy或醋酸甲醇固定2030min(2)室溫投入1MHC112min(3)60℃投入1MHCl810min(4)10℃暗處投入Schiff劑中染色15h(5)漂洗液洗2x2min(6)蒸餾水漂洗2x2min(7)酒精75%100%脫水(8)透化:二甲苯2次每次3min(9)蓋片置于載物片上滴少許樹膠再加較大蓋

5、片覆蓋(10)蓋片加微型重物加壓數(shù)日樹膠干后觀察.鏡下可見細(xì)胞核成粉紅色至紫紅色胞質(zhì)無色.吖啶橙染色熒光觀察法:(1)蓋片培養(yǎng)細(xì)胞溫Hanks洗35s(2)投入95%酒精或醋酸甲醇min(3)1%醋酸作用30s(4)1104吖啶橙染30s或1min(5)0.1MCaCl2處理30s2min(6)PBS漂洗3次每次數(shù)秒(7)PBS封片熒光顯微鏡下直接觀察并拍照.3.透射電子顯微鏡:常用超薄切片法、冷凍超薄切片法、冷凍復(fù)型法超薄切片法:取材

6、固定(戊二醛2.5%5%鋨酸1%高錳酸鉀甲醛、多聚甲醛)脫水二、免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)觀察細(xì)胞成分法1.原理:用熒光素或酶等標(biāo)記物或顯色物標(biāo)記特異性抗體通過免疫學(xué)反應(yīng)與細(xì)胞內(nèi)的相應(yīng)抗原結(jié)合形成帶有熒光素或顯色物的抗原抗體復(fù)合物.可用熒光顯微鏡或普通光學(xué)顯直接法:(1)標(biāo)本固定PBS洗滌23min(2)1%H2O2(1%H2O2甲醇)抑制內(nèi)源性過氧化物酶室溫1020min(3)正常血清(1:10)孵育室溫20min(4)滴加酶標(biāo)記的抗體37℃1

7、h或4℃過夜PBS洗23min(5)DABH2O2顯色510min鏡下控制染色結(jié)果(6)充分水洗后復(fù)染、脫水、透明、封片、鏡檢.目前只用于單克隆抗體的篩選及酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn).間接法:(1)(3)同直接法(4)滴加第一抗體37℃1h或4℃過夜PBS洗滌33min(5)滴加酶標(biāo)二抗室溫1hPBS洗滌33min(6)0.04%DAB0.03H2O2顯色510min(7)充分水洗后復(fù)染、脫水、透明、封片、鏡檢.PAP法(過氧化物酶抗過氧化物酶抗

8、體復(fù)合物法)PAP的基本原理是在間接法的基礎(chǔ)上即在加完酶標(biāo)二抗以后再加一個(gè)PAP復(fù)合物(過氧化物酶抗過氧化物酶抗體復(fù)合物)PAP復(fù)合物為由3個(gè)酶分子和2個(gè)抗酶抗體亞單位構(gòu)成的復(fù)環(huán)形復(fù)合物其穩(wěn)定性很強(qiáng)沖洗時(shí)不會(huì)脫落.在這種方法中PAP復(fù)合物中的抗酶抗體與特異性一抗必須來自同一種屬動(dòng)物.其優(yōu)點(diǎn)是比間接法更為靈敏而且背景染色低.1)(3)同直接法(4)滴加一抗室溫1h或4℃過夜PBS洗33min(5)滴加二抗室溫30minPBS洗33min(

9、6)加PAP復(fù)合物室溫60minPBS洗33min(7)0.04%DAB0.03H2O2顯色510min(8)充分水洗蘇木精復(fù)染封片觀察.雙PAP法:這種方法可在復(fù)合物體系中連接更多的PAP復(fù)合物對(duì)抗原可進(jìn)一步放大因此靈敏度更為增強(qiáng)適用于微量抗原的檢測(cè).(1)(6)同單PAP法(7)二次加二抗PBS洗(8)二次加PAPPBS洗(9)0.04%DAB0.03H2O2顯色510min(10)蘇木素復(fù)染核封片鏡檢.ABC法(卵白素生物素過氧化