動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)課件

1、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng),中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,前 言,1885年Roux最早嘗試使組織離體培養(yǎng)，材料是雞胚神經(jīng)板，采用生理鹽水為培養(yǎng)液，并首次采用組織培養(yǎng)這個(gè)術(shù)語(yǔ)。1907年Harrison 和1912年Carrel開始把組織培養(yǎng)作為一種方法，用于研究離體動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)。由于組織培養(yǎng)在醫(yī)學(xué)研究中的應(yīng)用，如抗病毒疫苗的生產(chǎn)等，現(xiàn)已經(jīng)逐漸發(fā)展成為一門精細(xì)技術(shù)。許多細(xì)胞株、細(xì)胞系的培育成功，尤其是以人的腫瘤組織為材料建立的各種細(xì)胞系，如Hela細(xì)

2、胞系（Gey，1952），可用來(lái)進(jìn)行一系列研究，更加促進(jìn)了組織培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展。,組織培養(yǎng)中熱門的研究領(lǐng)域,1)細(xì)胞內(nèi)部的活動(dòng)，如DNA的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄、蛋白質(zhì)合成、能量代謝；2)細(xì)胞內(nèi)部的流動(dòng)，如RNA從細(xì)胞核向細(xì)胞質(zhì)方向運(yùn)轉(zhuǎn)，激素受體復(fù)合物的易位等；3)生態(tài)學(xué)，如營(yíng)養(yǎng)、感染、病毒或化學(xué)誘變、藥物作用；4)細(xì)胞與細(xì)胞之間的相互作用，如胚胎誘導(dǎo)、細(xì)胞群體的動(dòng)力學(xué)等。,組織培養(yǎng)的分類及基本概念,分類:1.組織培養(yǎng)(Tissue Cult

3、ure) 指的是從體內(nèi)取出組織，在模擬體內(nèi)生理環(huán)境，無(wú)菌、適當(dāng)溫度和一定營(yíng)養(yǎng)條件下，使之生存和生長(zhǎng)并維持其結(jié)構(gòu)和功能的方法。2.細(xì)胞培養(yǎng)(Cell Culture) 培養(yǎng)物是單個(gè)細(xì)胞和細(xì)胞群。3.器官培養(yǎng)（Organ Culture） 培養(yǎng)的是器官的原基、器官的一部分或整個(gè)器官，使之在體外生存、生長(zhǎng)和保持一定功能的方法。,組織培養(yǎng)的細(xì)胞生物學(xué)特點(diǎn):,1.體內(nèi)外細(xì)胞的差異：當(dāng)人工條件和體內(nèi)實(shí)際情況不完全相同時(shí)，細(xì)胞在體外培養(yǎng)后，一旦失

4、去神經(jīng)體液調(diào)節(jié)和細(xì)胞間相互影響，生活在缺乏動(dòng)態(tài)平衡的環(huán)境中，發(fā)生變化則是必然。細(xì)胞最多見(jiàn)的表現(xiàn)是：返祖（Atavism）現(xiàn)象，即失去原有組織結(jié)構(gòu)和細(xì)胞形態(tài)、分化減弱或不顯、細(xì)胞趨單一化、不死性、惡性狀。2.細(xì)胞增殖和分化：是細(xì)胞生命進(jìn)化中所獲得的基本屬性，增殖使細(xì)胞數(shù)量增多；分化使機(jī)體結(jié)構(gòu)和功能多樣化，最后演變成完整的有機(jī)體。,培養(yǎng)細(xì)胞的分化,細(xì)胞分化機(jī)制是極其復(fù)雜的，是在細(xì)胞與細(xì)胞、細(xì)胞與體液和細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)相互作用下，眾多基因參

5、與、經(jīng)過(guò)多階段和多環(huán)節(jié)完成的動(dòng)態(tài)演變過(guò)程。,不適應(yīng)（Deadaption） 細(xì)胞在體內(nèi)時(shí)所擁有的分化特性減弱或不顯。例如肝細(xì)胞在體外喪失了產(chǎn)生酪氨酸轉(zhuǎn)移酶的特性。脫分化（去分化）（Dedifferentiation） 由于基因變異而使細(xì)胞失去分化能力。如肝細(xì)胞失掉產(chǎn)生精氨酸酶及氨基酸轉(zhuǎn)移酶的特性后，儲(chǔ)存肝糖元的能力喪失，并很難再現(xiàn)。,培養(yǎng)細(xì)胞的分化,不適應(yīng)和脫分化兩個(gè)概念不同：不適應(yīng)

6、是因?yàn)樯鏃l件改變而使分化發(fā)生抑制；從分子水平考慮，脫分化很可能是基因變異所致。,培養(yǎng)細(xì)胞的分化,培養(yǎng)細(xì)胞的形態(tài),1.貼附型：1）成纖維細(xì)胞：心肌細(xì)胞，血管內(nèi)皮細(xì)胞等2）上皮型細(xì)胞：消化管外皮細(xì)胞，肝臟上皮細(xì)胞等3）游走型細(xì)胞：神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞4）多形型細(xì)胞：神經(jīng)組織細(xì)胞2.懸浮型：如癌細(xì)胞,培養(yǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖,1.原代培養(yǎng)（Primary Culture）階段：或稱初代培養(yǎng)。從體內(nèi)取出組織接種培養(yǎng)到第一次傳代，隨不同的組織時(shí)間

7、長(zhǎng)短不一，一般為1~4w2.傳代培養(yǎng)（Subculture）階段：或稱繼代培養(yǎng)。也就是細(xì)胞系（Cell line）階段，細(xì)胞增殖旺盛，一般細(xì)胞可傳代10-50代）。,3.衰退階段： 自發(fā)性轉(zhuǎn)化（Spontaneous Transformation）：其標(biāo)志是獲得永生性（Immortality）或惡性性（Malignancy）: 細(xì)胞獲持久性增殖能力，這樣的細(xì)胞群體稱無(wú)限細(xì)胞系(Infinite cell line)或連續(xù)細(xì)胞系(

8、Continuous cell line)。 如：BHK（倉(cāng)鼠腎成纖維細(xì)胞），F(xiàn)9（小鼠胚胎癌細(xì)胞），M2R（黑色素瘤細(xì)胞）等。,培養(yǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖,培養(yǎng)細(xì)胞的傳代培養(yǎng),當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)到一定密度后，都需要做傳代處理，傳代的頻率或間隔與培養(yǎng)液的性質(zhì)、接種細(xì)胞的數(shù)量和細(xì)胞增殖速度有關(guān)。所謂細(xì)胞“一代”，即從細(xì)胞接種到分離再培養(yǎng)的一段時(shí)間。如某一細(xì)胞系為50代即該細(xì)胞已傳代50次。,細(xì)胞傳代的三個(gè)階段,1）潛伏期（Latent pha

9、se）： 細(xì)胞從接種到貼壁生長(zhǎng)繁殖的一段時(shí)間。二倍體細(xì)胞該期時(shí)間長(zhǎng)（24~96h）；連續(xù)細(xì)胞系時(shí)間短（10~30min）。,2) 指數(shù)生長(zhǎng)期（Logarthmic growth phase）： 細(xì)胞增殖最旺盛時(shí)期，一般用細(xì)胞分裂指數(shù)（Mitotic index，MI）表示，即細(xì)胞群中每1000個(gè)細(xì)胞中的分裂相數(shù)。體外培養(yǎng)細(xì)胞分裂指數(shù)介于0.1~0.5%，且受細(xì)胞種類培養(yǎng)液成分、pH、溫度等影響。,細(xì)胞傳代

10、的三個(gè)階段,,指數(shù)生長(zhǎng)期是細(xì)胞活力最好的時(shí)期，在接種細(xì)胞數(shù)量適宜情況下，指數(shù)生長(zhǎng)期持續(xù)3-5d后，隨細(xì)胞數(shù)量不斷增多，生長(zhǎng)空間日趨減少，細(xì)胞相互接觸匯合成片，呈現(xiàn)接觸抑制（Contact inhibition）。而惡性細(xì)胞則無(wú)接觸抑制現(xiàn)象，因此接觸抑制可作為區(qū)分正常與癌細(xì)胞標(biāo)志之一。癌細(xì)胞則由于營(yíng)養(yǎng)成分的消耗和細(xì)胞代謝產(chǎn)物的影響而發(fā)生密度抑制（Density inhibition）,3)停滯期（Stagnate phase）：

11、 即細(xì)胞數(shù)量達(dá)到飽和密度后，細(xì)胞與營(yíng)養(yǎng)液的交換面積減少，代謝產(chǎn)物積累，PH下降細(xì)胞停止增殖，進(jìn)入停滯期。在此時(shí)應(yīng)及時(shí)進(jìn)行換液傳代，否則因細(xì)胞中毒受損，大量細(xì)胞出現(xiàn)死亡，至少再傳1-2代后，細(xì)胞才能恢復(fù)。,細(xì)胞傳代的三個(gè)階段,細(xì)胞培養(yǎng)的基本條件,1)儀器和設(shè)備:常規(guī)的細(xì)胞培養(yǎng)設(shè)備：如CO2孵箱；培養(yǎng)器材：如培養(yǎng)瓶，純水設(shè)備，干燥消毒除菌設(shè)備，清洗設(shè)備等。2)培養(yǎng)液:目前常用的基礎(chǔ)培養(yǎng)液均已商品化，如RPMI1640，MEM，DMEM

12、，F(xiàn)12等，可根據(jù)培養(yǎng)需求合理選擇。,細(xì)胞培養(yǎng)的基本條件,3)血清：一般常用為小牛血清(包括胎牛血清)，人血清和其它動(dòng)物血清。 由于不同的研究目的，血清成分往往干擾研究實(shí)驗(yàn)，如進(jìn)行藥物和受體及營(yíng)養(yǎng)等方面的研究時(shí)，需要使用無(wú)血清培養(yǎng)基。,細(xì)胞培養(yǎng)的基本條件,4)平衡鹽溶液:主要用于作為稀釋和灌注的液體，維持細(xì)胞滲透壓，提供緩沖系統(tǒng)，使培養(yǎng)液的酸監(jiān)度維持在培養(yǎng)細(xì)胞生理范圍內(nèi)，提供細(xì)胞正常代謝所需的水分和無(wú)機(jī)離子等。常用的有P

13、BS，Hank’s等。5)抗生素:常用為青霉素（每毫升培養(yǎng)液50~100單位）和鏈霉素（每毫升培養(yǎng)液50~100微克）。,6)其它添加成分：緩沖系統(tǒng)，常用為HEPES（N’-2-hydroxy-ethylpiperazine-N’-ethanesulfonic acid），緩沖效能(pKa)在20℃時(shí)為7.55，37℃為7.31； HEPES不是起維持pH恒定的作用，而是起恒定和抵抗快速pH變化的，所以調(diào)整pH常常用NaHCO3溶液

14、。有機(jī)補(bǔ)充物，如丙酮酸鈉， 谷胺酰氨等。促細(xì)胞分裂因子，如生長(zhǎng)因子類的FGF(成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子)，EGF(表皮生長(zhǎng)因子)。貼壁和鋪展因子，如膠原蛋白，纖粘蛋白等?？筛鶕?jù)培養(yǎng)細(xì)胞的特殊要求進(jìn)行添加。,細(xì)胞培養(yǎng)的基本條件,培養(yǎng)液的物理性質(zhì),pH值：大多數(shù)細(xì)胞在pH7.4時(shí)生長(zhǎng)最好，一般不低于6.8，不高于7.6。酚紅是常用的指示劑，用來(lái)檢測(cè)PH的變化：紅色--pH7.4，橙色--pH7.0，黃色--pH6.5，藍(lán)紅色--pH7.6

15、，紫色--pH7.8。溫度：溫度除直接影響細(xì)胞生長(zhǎng)外，還與培養(yǎng)液的pH值有關(guān)，溫度低時(shí)CO2溶解性增加，從而影響pH。,滲透壓：培養(yǎng)液滲透壓一般介于260~320 mosm/kg之間。 人類血漿滲透壓290mosm /kg，小鼠類為310mosm /kg。粘度：由于血清的存在，直接影響培養(yǎng)液粘度。表面張力：培養(yǎng)液的表面張力有利于培養(yǎng)物粘著于底物上面。,培養(yǎng)液的物理性質(zhì),細(xì)胞培養(yǎng)的基本方法,1.組織、細(xì)胞的解離方法1.1

16、解離組織：在無(wú)菌情況下采取動(dòng)物的組織或器官，放在含有抗生素的平衡鹽溶液(BSS)中，然后盡快在超凈臺(tái)或無(wú)菌室內(nèi)進(jìn)行解離處理。解離時(shí)應(yīng)注意:1) 盡可能將脂肪和壞死組織去除干凈；2) 剪碎組織時(shí)，避免損傷組織塊；3) 解離組織用的各種酶系，需要先進(jìn)行低速離心。,解離細(xì)胞,常用酶和鰲合劑進(jìn)行解離：當(dāng)實(shí)驗(yàn)室需要制備具有均勻細(xì)胞層的培養(yǎng)物；從單個(gè)細(xì)胞出發(fā)獲得細(xì)胞群體；從一定量的組織中獲得最多的細(xì)胞量時(shí)。,解離細(xì)胞的方法,1）胰蛋白

17、酶解離細(xì)胞法：所需時(shí)間較短，主要缺點(diǎn)是破損細(xì)胞。2）膠原酶解離細(xì)胞法：這種方法對(duì)解離胚胎性、正常和惡性組織是很有效的。膠原酶最終濃度200u/ml，36.5℃溫育，一般溫育4-48h。膠原酶和透明質(zhì)酸酶協(xié)同作用有助于分離大鼠或兔的肝臟組織。3）機(jī)械解離細(xì)胞法：比酶法所需時(shí)間短，但細(xì)胞存活率較低。4）螯合劑解離細(xì)胞法：分離效果差,原代細(xì)胞培養(yǎng),1）外植塊培養(yǎng)：外植塊在一定限度內(nèi)可保持其原有組織結(jié)構(gòu)，有利于其適應(yīng)體外培養(yǎng)環(huán)境。短期培養(yǎng)

18、的外植塊成為細(xì)胞培養(yǎng)的材料來(lái)源之一。2）單層細(xì)胞培養(yǎng)：每隔1~3d換液一次，細(xì)胞長(zhǎng)成單層后傳代培養(yǎng)。,3）懸浮細(xì)胞培養(yǎng)：使細(xì)胞成懸浮狀態(tài)在培養(yǎng)液中連續(xù)生長(zhǎng)。由于細(xì)胞本身是不粘附的，如小鼠白血病細(xì)胞和腹水腫瘤細(xì)胞；通過(guò)機(jī)械攪動(dòng)使細(xì)胞保持懸浮狀態(tài)；通過(guò)選擇培養(yǎng)得到能懸浮生長(zhǎng)的細(xì)胞進(jìn)行懸浮培養(yǎng)。,原代細(xì)胞培養(yǎng),細(xì)胞培養(yǎng)中應(yīng)注意的幾個(gè)問(wèn)題,1）培養(yǎng)液和培養(yǎng)物的比例：一定濃度的培養(yǎng)液僅能支持一定數(shù)量的細(xì)胞生長(zhǎng)，不能盲目增加每單位體積的細(xì)胞

19、濃度。2）PH：初培養(yǎng)pH應(yīng)為7.4，培養(yǎng)過(guò)程應(yīng)不低于7.0。3）培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)的空間：一般培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)培養(yǎng)液與液面上的空間體積之比為1:10。,4）容積、深度、表面面積：培養(yǎng)液體積與表面面積的比例為0.2~0.5ml/cm2。需高濃度氧的，在淺的培養(yǎng)液（2mm）中生長(zhǎng)較好；需要低濃度氧的。在深的培養(yǎng)液（5mm）中生長(zhǎng)較好。5）去除死細(xì)胞6）溫度控制：動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)對(duì)溫度波動(dòng)的敏感性很大。溫度低于36.5℃，細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢；溫度高于37.5℃

20、，細(xì)胞存活力降低。,細(xì)胞培養(yǎng)中應(yīng)注意的幾個(gè)問(wèn)題,細(xì)胞系及其鑒定,原代培養(yǎng)的培養(yǎng)物中所含的細(xì)胞類型多而復(fù)雜。因此在培養(yǎng)初期，存活和生長(zhǎng)的細(xì)胞類型也是多種多樣的。所以再培養(yǎng)不僅僅是為了維持細(xì)胞不斷地生長(zhǎng)，而且是使培養(yǎng)物逐步成為具有增殖能力、特征專一、類型均勻的培養(yǎng)細(xì)胞，即細(xì)胞系(Cell line)。,細(xì)胞克隆技術(shù),培育細(xì)胞系可采用細(xì)胞克隆技術(shù)。 一個(gè)克隆的細(xì)胞群體是從一個(gè)單一母細(xì)胞繁殖而來(lái)，分離單一細(xì)胞并使其繁殖為一細(xì)胞群體的方法稱為

21、克隆化(cloning)。,細(xì)胞克隆技術(shù)的方法,1.稀釋鋪板法2.飼養(yǎng)層克隆法3.膠原膜板或纖維蛋白膜板克隆法4.瓊脂克隆法5.在瓊脂基底上用甲基纖維素克隆法,細(xì)胞系鑒定,當(dāng)細(xì)胞系建立后，應(yīng)對(duì)細(xì)胞系進(jìn)行一系列鑒定后，才能應(yīng)用于細(xì)胞生物學(xué)、免疫學(xué)、細(xì)胞遺傳學(xué)等方面的研究。鑒定內(nèi)容應(yīng)包括:1)細(xì)胞系的細(xì)胞來(lái)源；2)鑒定細(xì)胞系的純度，即除了主類細(xì)胞外，還雜有哪類細(xì)胞；3)細(xì)胞系的穩(wěn)定性，即在細(xì)胞連續(xù)培養(yǎng)過(guò)程中主要指標(biāo)應(yīng)無(wú)明顯變化

22、；4)累積細(xì)胞系的形態(tài)及其表達(dá)特征的基本數(shù)據(jù)，以及其與來(lái)源細(xì)胞的差異等；,細(xì)胞系鑒定指標(biāo),1.形態(tài)學(xué)：活細(xì)胞觀察；固定染色觀察培養(yǎng)細(xì)胞。2.染色體： 染色體是一種鑒定細(xì)胞系的種屬、性別來(lái)源較為確切的指標(biāo)；也是檢查細(xì)胞系是否趨于穩(wěn)定，在離體培養(yǎng)條件下細(xì)胞有否發(fā)生轉(zhuǎn)化的可靠指標(biāo)；是區(qū)別正常細(xì)胞與惡性細(xì)胞的指標(biāo)。 采用染色體數(shù)目、核型分析以及染色體分帶技術(shù)檢測(cè)。,3.同工酶譜： 通常采用G6P

23、D(葡萄糖-6-磷酸脫氫酶)、LDH(乳酸脫氫酶)、核苷磷酸化酶三種方法，根據(jù)條件選擇。,細(xì)胞系鑒定指標(biāo),4.細(xì)胞DNA遺傳特征: 限制性片斷長(zhǎng)度多態(tài)性(restriction fragment length polymorphism RFLP) 是指那些在生物進(jìn)化過(guò)程中，DNA序列發(fā)生某些中性突變，突變的結(jié)果是失去或獲得一個(gè)酶切點(diǎn)，因此當(dāng)基因組DNA用限制性內(nèi)切酶酶切后，限制性內(nèi)切酶片斷加長(zhǎng)或縮短；用同源的克隆DNA為探針可

24、以探測(cè)出來(lái)。另外也可能在生物進(jìn)化過(guò)程中DNA分子結(jié)構(gòu)發(fā)生重排，使DNA堿基排列序列改變，影響內(nèi)切酶切點(diǎn),使內(nèi)切酶酶切片斷呈多態(tài)性。 一般采用Southern印跡雜交法檢測(cè)。,細(xì)胞系鑒定指標(biāo),培養(yǎng)細(xì)胞的污染問(wèn)題及檢測(cè),細(xì)胞培養(yǎng)的污染問(wèn)題十分重要，一旦發(fā)生污染，將導(dǎo)致前功盡棄。所以細(xì)胞培養(yǎng)一定要建立無(wú)菌觀念。遇到培養(yǎng)污染要分析原因，及時(shí)處理。,細(xì)胞污染的種類和判定,細(xì)胞培養(yǎng)中常見(jiàn)的污染物有細(xì)菌、酵母菌、真菌、支原體和病毒等。在出現(xiàn)以

25、下情況時(shí)培養(yǎng)的細(xì)胞可能有污染：1) 培養(yǎng)液的酸堿度發(fā)生異常的改變。2)培養(yǎng)液出現(xiàn)混濁。3)光鏡觀察到菌絲和顆粒。4)細(xì)胞出現(xiàn)死亡或增殖緩慢等。,污染物的檢測(cè),1.細(xì)菌和真菌污染的檢測(cè)：1）涂片染色鏡檢；2）接種培養(yǎng)：Trypticase大豆肉湯、BHI、Thioglycocollate肉湯和血瓊脂板適于廣泛的細(xì)菌檢測(cè)；Sabouraud肉湯、YM肉湯和營(yíng)養(yǎng)肉湯適于檢測(cè)真菌。 檢測(cè)到陽(yáng)性結(jié)果后，應(yīng)高壓滅菌處理污染

26、的培養(yǎng)物及其用具。,,2.支原體檢測(cè): 支原體污染細(xì)胞后，能抑制細(xì)胞代謝和生長(zhǎng)，改變核酸合成，影響細(xì)胞的抗原性，引起細(xì)胞染色體改變，干擾病毒的復(fù)制，以及具有類病毒作用。在培養(yǎng)細(xì)胞初期，由于支原體對(duì)細(xì)胞的繁殖影響較小而往往被忽略。,污染物的檢測(cè),支原體檢測(cè)方法和處理,1）熒光技術(shù)檢測(cè)：支原體含有DNA，能與一種熒光染料Hoechest 33258特異性的結(jié)合，可根據(jù)細(xì)胞表面的熒光來(lái)顯示細(xì)胞是否污染有支原體。2）直接培養(yǎng)

27、法：實(shí)驗(yàn)室常用。3）放射自顯影檢測(cè)：4）DNA分子雜交： 檢測(cè)完畢后，所有實(shí)驗(yàn)用具均應(yīng)經(jīng)過(guò)高壓消毒處理。,5）污染支原體后的處理： 抗生素處理：如加入泰樂(lè)菌素等。 共培養(yǎng)法：與巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)。 重新克隆法：抗生素處理后，將細(xì)胞稀釋后傳代，每周換2次含抗生素的新鮮培養(yǎng)液，4~5周后，重復(fù)克隆2次。 過(guò)濾法：0.22µm孔徑濾膜正壓過(guò)濾。,支原體檢測(cè)方法和處理,污染病毒的檢測(cè),1）致細(xì)胞病變效應(yīng)（CPE）

28、或集落的檢測(cè)：采用相差顯微鏡檢測(cè)2）血細(xì)胞吸附試驗(yàn)；3）雞胚接種。,細(xì)胞間交叉污染,為避免細(xì)胞間交叉污染，應(yīng)注意：了解各細(xì)胞系的特征；培養(yǎng)各細(xì)胞系的操作手續(xù)要快速；培養(yǎng)各細(xì)胞系不用同一瓶的培養(yǎng)液和酶等；吸過(guò)培養(yǎng)液和細(xì)胞懸液的吸管，不能放回儲(chǔ)存培養(yǎng)液和酶的瓶?jī)?nèi)；經(jīng)常檢查培養(yǎng)物特征，注意任何突然的形態(tài)學(xué)改變，通過(guò)染色體或同工酶譜分析，檢查是否有交叉污染。,在體外培養(yǎng)工作中，常要將體外培養(yǎng)物進(jìn)行冷凍保存，在需要時(shí)再?gòu)?fù)溫融解進(jìn)行體

29、外培養(yǎng)（復(fù)蘇）。要獲得好的凍存與復(fù)蘇效果，必須了解如下幾個(gè)問(wèn)題：冷凍速率、復(fù)溫速率、冷凍保護(hù)劑，冷凍保存溫度。,細(xì)胞保存,1、 冷凍速率 冷凍速率是指降溫的速度，是活細(xì)胞能否被冷凍到一個(gè)能永久保存的溫度的一個(gè)主要因素。冷凍速率太快或太慢都會(huì)造成細(xì)胞的損傷，只有以最適的冷凍速率冷凍細(xì)胞，才能獲得最佳的冷凍保存效果。 不同細(xì)胞最適冷凍速率的值也有所不同，如小鼠骨髓干細(xì)胞、酵母、人紅細(xì)胞最適冷凍速度分別是1.6℃、7℃和200/分。所

30、以一種細(xì)胞冷凍保存之前要測(cè)試出其最適冷凍速度，擬保證獲得最高冷凍存活率。,細(xì)胞保存,2、復(fù)溫速率 復(fù)溫速率是指細(xì)胞復(fù)蘇時(shí)溫度升高的速度。冷凍保存的細(xì)胞復(fù)蘇時(shí)，復(fù)溫速率不當(dāng)也會(huì)降低冷凍存活率。一般來(lái)說(shuō)復(fù)溫速度越快越好，37℃水浴中，1～2分鐘內(nèi)要完成復(fù)溫。,細(xì)胞保存,3、冷凍保護(hù)劑 冷凍保護(hù)劑是指可以保護(hù)細(xì)胞免受冷凍損傷的物質(zhì)，常被加到一定的溶液中進(jìn)行配制，作為冷凍保護(hù)液。紅細(xì)胞、大多數(shù)微生物和極少數(shù)有核的哺乳類動(dòng)物細(xì)胞懸浮在

31、水或簡(jiǎn)單的鹽溶液中而不加冷凍保護(hù)劑，以最適的冷凍速率冷凍保存可獲得活的凍存物。,細(xì)胞保存,對(duì)大多數(shù)有核哺乳類動(dòng)物細(xì)胞來(lái)說(shuō)，在不加冷凍保護(hù)劑的情況下，無(wú)最適冷凍速率可言，也不能獲得活的凍存物。 目前冷凍保護(hù)劑可分為滲透性和非滲透性兩類。具有滲透性的冷凍保護(hù)劑可以滲透到細(xì)胞內(nèi)，一般是一些小分子的物質(zhì)，主要有甘油、DMSO、乙二醇、丙二醇、乙酰胺、甲醇等，。非滲透性冷凍保護(hù)劑不能滲透到細(xì)胞內(nèi)，一般是些大分子物質(zhì)，主要有聚乙烯吡咯烷酮（P