動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)

1、動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)、凍存與復(fù)蘇動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)、凍存與復(fù)蘇1熟悉細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中的無(wú)菌操作技術(shù)。2了解細(xì)胞原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)的基本方法和主要操作步驟。3了解體外培養(yǎng)細(xì)胞的液氮凍存與復(fù)蘇技術(shù)?！緦?shí)驗(yàn)原理】細(xì)胞培養(yǎng)(cellculture)是指從機(jī)體內(nèi)取出某種組織或細(xì)胞，模擬機(jī)體內(nèi)的生理?xiàng)l件使其在體外生存、生長(zhǎng)和繁殖的過(guò)程。細(xì)胞的體外培養(yǎng)在細(xì)胞生物學(xué)和醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域有著極為廣泛的用途，這一技術(shù)已成為研究細(xì)胞生理、細(xì)胞增殖、細(xì)胞遺傳、細(xì)胞癌變和細(xì)胞工程

2、等課題的一項(xiàng)不可缺少的手段。細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的突出優(yōu)點(diǎn)在于能為研究者提供大量的生物性狀相同的細(xì)胞作為研究對(duì)象，便于人們?cè)隗w外利用各種不同的方法從不同的角度研究細(xì)胞生命活動(dòng)的規(guī)律。另外，利用細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)還可使人們較為方便地研究各種物理、化學(xué)和生物因素對(duì)細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的影響。細(xì)胞培養(yǎng)可分為原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)2種情況。所謂原代培養(yǎng)(primaryculture)是指直接從機(jī)體取出組織或細(xì)胞后所進(jìn)行的首次培養(yǎng)。而傳代培養(yǎng)(subculture)是指

3、當(dāng)原代培養(yǎng)的細(xì)胞增殖到一定密度后，將其從原培養(yǎng)容器中取出，以1：2或其他比例轉(zhuǎn)移到另一個(gè)或幾個(gè)容器中所進(jìn)行的再培養(yǎng)。傳代培養(yǎng)可簡(jiǎn)稱(chēng)傳代。在體外培養(yǎng)過(guò)程中，要使細(xì)胞能正常地生長(zhǎng)、繁殖，需經(jīng)常對(duì)其進(jìn)行傳代。傳代的累積次數(shù)就是細(xì)胞的代數(shù)。在從事細(xì)胞培養(yǎng)工作時(shí)常常會(huì)接觸到細(xì)胞系(cellline)和細(xì)胞株(cellstrain)這兩個(gè)容易混淆的概念。一般認(rèn)為，細(xì)胞系指通過(guò)原代培養(yǎng)并經(jīng)傳代后所形成的細(xì)胞群體，由于細(xì)胞系來(lái)源于原代培養(yǎng)，而原代培養(yǎng)物

4、中所含的細(xì)胞種類(lèi)較多，故一個(gè)細(xì)胞系往往由多個(gè)生物學(xué)性狀不同的細(xì)胞群體所組成；而細(xì)胞株是利用單細(xì)胞分離培養(yǎng)法或克隆形成法從原代培養(yǎng)物或細(xì)胞系中選擇出的細(xì)胞群體，一個(gè)細(xì)胞株往往具有特殊的生物學(xué)性狀或標(biāo)記并可持續(xù)存在。D—Hanks原液：分別稱(chēng)取NaCl80.0g、Na2HPO42H2O0.6g、KCl4.0g、KH2P040.6g、NaHC033.5g，加三蒸水溶解至1000ml。配制時(shí)要注意按了頃序逐一加入溶解，應(yīng)等前一種藥品完全溶解后再

5、加下一種藥品，原液配好后應(yīng)分裝于250mi或500ml玻璃瓶中，高壓滅菌，置冰箱內(nèi)貯存。D—Hanks工作液：取D—Hanks原液100ml，加三蒸水896ml，再加0.5％的酚紅溶液4ml，混合均勻即成。(4)0.25％胰蛋白酶(pH7.2—7.6)：稱(chēng)取活性為1：250的胰蛋白粉劑0.25g，另準(zhǔn)備D—Hanks工作液100ml。先用少量D—Hanks工作液將胰蛋白酶粉調(diào)成糊狀，再將剩余的D—Hanks工作液全部加入，充分?jǐn)嚢枋姑赋?/p>

6、分溶解，必要時(shí)可將容器置于36℃恒溫水浴箱中，直至酶液清亮，再用NaHC0，調(diào)pH至7.2—7.6。然后用玻璃濾器除菌，分裝于青霉素小瓶中，密封后置冰箱冷凍室(—18℃)中貯存。(5)05％酚紅溶液：稱(chēng)取0.5g酚紅粉置干燥研缽中研磨均勻，邊磨邊加入0.1movlLNaOH12ml，使之完全溶解，然后加三蒸水至100ml，4℃冰箱保存。(6)細(xì)胞凍存培養(yǎng)液：在含20％—30％小牛血清的1640培養(yǎng)液中加入二甲亞砜，使其終濃度為10％(或

7、加入丙三醇并使終濃度為5％)?！緝?nèi)容與方法】一、實(shí)驗(yàn)過(guò)程中無(wú)菌操作的要求一、實(shí)驗(yàn)過(guò)程中無(wú)菌操作的要求在整個(gè)細(xì)胞體外培養(yǎng)過(guò)程中，要始終保持無(wú)菌的概念，在操作的眾多環(huán)節(jié)中要注意消毒滅菌，努力做到最大限度的無(wú)菌，嚴(yán)防細(xì)菌的污染，否則將導(dǎo)致細(xì)胞培養(yǎng)的失敗。1培養(yǎng)用品的清洗消毒：實(shí)驗(yàn)中所需的玻璃器皿(如培養(yǎng)瓶、離心管、吸管、小瓶等)和器械(如剪刀、鑷子等)應(yīng)徹底清洗干凈，干燥后用牛皮紙包好置高壓蒸汽消毒鍋中消毒滅菌(蒸汽壓力為103kPa，20分