SARS-COV的S蛋白引起急性肺損傷可能的免疫機制研究.pdf

1、目的：本研究將SARS-COV的S蛋白及STAT1抑制劑作用于宿主細胞及動物，觀察其發(fā)生的免疫和病理變化，了解其可能的信號轉導通路，試圖揭示S蛋白引起急性肺損傷的可能機制。 研究內(nèi)容和方法： 一、研究SARS-COV的S蛋白對離體培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細胞釋放細胞因子及趨化因子的影響 1、采用昆蟲-桿狀病毒表達系統(tǒng)表達SARS-COY全長重組S蛋白，并經(jīng)鎳親和磁珠法純化，WESTERN-BLOT鑒定。 2、原

2、代培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVEC)用膠原酶消化法獲得，經(jīng)形態(tài)學和免疫組化鑒定，用3-5代。 3、將不同濃度的S蛋白作用于原代培養(yǎng)的HUVEC，觀察其形態(tài)學變化并用液相芯片方法檢測細胞上清中細胞因子及趨化因子的變化。 4、將S蛋白作用于人支氣管上皮細胞16HBE，將新鮮分離的外周血單個核細胞(PBMCs)加入趨化小室上室，觀察16HBE產(chǎn)生的趨化因子對PBMCs的趨化作用。 二、研究SARS-COV的S蛋白誘導原

3、代培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細胞合成釋放gamma-干擾素可誘導的10Kda蛋白(IP-10)的信號分子機制 1、信號轉導通路發(fā)現(xiàn)者基因芯片檢測信號轉導通路相關基因的表達。 2、WESTERN-BLOT及電泳遷移率分析(EMSA)檢測S蛋白對轉錄激活因子1(STAT1)活化的影響 3、RT-PCR及液相芯片方法檢測S蛋白對HUVEC的IP-10基因表達及蛋白合成釋放的影響，以及轉錄激活因子1(STAT1)的活化在介導IP-

4、10表達中的地位。 4、STAT1抑制劑對S蛋白誘導的外周血單個核細胞趨化作用的影響。 三、探討SARS-COV的S蛋白誘導急性肺損傷的可能性以及IP-10的作用與地位；觀察STAT1抑制劑對急性肺損傷的影響。 1、BALB/C小鼠隨機分為PBS空白對照組、S蛋白組、S蛋白+STAT1抑制劑組(抑制劑組)和IP-10組，分別經(jīng)氣管滴注、尾靜脈注射的途徑注入，觀察其臨床癥狀、生存率。 2、分離小鼠雙肺稱取肺

5、濕重，并予以常規(guī)肺組織固定、包埋和切片，HE染色行病理學觀察。 3、免疫熒光方法檢測各組小鼠肺組織IP-10的表達。 結果： 一、SARS-COY的S蛋白作用于HUVEC形態(tài)學變化及產(chǎn)生細胞因子的特點： 1、S蛋白作用于HUVEC可引起細胞內(nèi)出現(xiàn)空泡，細胞變圓有脫落，甚至隨時間延長細胞破碎溶解，陽性對照組γ-干擾素(IFN-γ)組也可見小部分細胞脫落但未見空泡變性，脫落程度較S蛋白組輕。 2、基礎

6、狀態(tài)下HUVEC并不生成IP-10，S蛋白作用12小時后即可見IP-10生成達(888.82±211.96)pg/ml，呈顯著量效反應。但對其他參與免疫反應的Th1/Th2細胞因子(包括IFN-γ)及趨化因子影響不明顯。而IFN-γ不僅能誘導內(nèi)皮細胞IP-10的增高，而且能誘導其它因子的增高。 3、S蛋白刺激下的支氣管上皮細胞對PBMCs產(chǎn)生募集作用，該趨化作用通過加入人IP-10中和抗體可被阻斷。 二、SARS-COV

7、的S蛋白誘導HUVECIP-10表達可能的信號分子機制 1、基因芯片結果提示：S蛋白誘導了IFN-γ可誘導的信號通路相關基因的表達 2、WESTERN-BLOT方法結果表明：S蛋白作用于HUVEC誘導了STAT1的磷酸化。 3、EMSA結果證實：S蛋白作用于HUVEC，核蛋白可與ISRE和GASDNA基序結合。 4、RT-PCR及液相芯片結果證實：S蛋白誘導了HUVEC的IP-10基因表達及蛋白合成釋放；

8、STAT1抑制劑能夠從基因和蛋白水平完全阻斷S蛋白誘導HUVEC的IP-10表達。 5、STAT1抑制劑可以阻斷S蛋白誘導支氣管上皮細胞對外周血單個核細胞的趨化作用。 三、SARS-COV的S蛋白引起小鼠肺部的免疫損傷及STAT1抑制劑的作用 1、經(jīng)氣管滴注或尾靜脈注射S蛋白均可導致小鼠出現(xiàn)呼吸急促癥狀，甚至死亡。 2、經(jīng)氣管滴注或尾靜脈注射S蛋白的小鼠肺臟濕重增加，顯微鏡下可見肺泡正常結構破壞，間質(zhì)增厚

9、，炎性細胞浸潤，上皮細胞和血管內(nèi)皮細胞的腫脹脫落。 3、經(jīng)氣管滴注小鼠IP-10蛋白小鼠出現(xiàn)上述類似的肺損傷表現(xiàn)。 4、經(jīng)氣管滴注或尾靜脈注射S蛋白的小鼠肺內(nèi)氣管上皮細胞和血管內(nèi)皮細胞均強陽性表達IP-10。 5、STAT1抑制劑能夠減輕S蛋白引起的小鼠肺部病理損傷和臨床癥狀。 6、STAT1抑制劑可抑制S蛋白誘導小鼠肺內(nèi)IP-10表達。 結論： 1、SARS-COV可通過其S蛋白誘導血管