SARS-CoV S蛋白S1區(qū)克隆、血清學(xué)研究及其單克隆抗體制備.pdf

1、嚴(yán)重急性呼吸綜合征(Severeacuterespiratorysyndrome，SARS)是一種新出現(xiàn)的突發(fā)性傳染性疾病，其病原體為新型冠狀病毒，命名為SARS相關(guān)冠狀病毒(SARS-associatedcoronavirus，SARS-CoV)。該病毒有四種結(jié)構(gòu)蛋白，包括spike(S)蛋白、envelope(E)蛋白和membrane(M)蛋白三種膜蛋白和nucleocapsid(N)核心蛋白。S蛋白是病毒顆粒最大的結(jié)構(gòu)蛋白和最重

2、要的病毒表面抗原，已知關(guān)于其他冠狀病毒和SARS-CoV的研究均表明S蛋白是病毒顆粒與受體結(jié)合的媒介分子，也是病毒中和性抗體結(jié)合的靶點(diǎn)，在病毒治療和疫苗研究中起著重要作用。該蛋白屬于Ⅰ型膜蛋白，由1255個氨基酸組成，共有24個糖基化位點(diǎn)。根據(jù)功能劃分，S蛋白可分成兩部分：膜外的S1區(qū)(形成S蛋白的球形部分)和穿膜的S2區(qū)(形成穿膜棒狀結(jié)構(gòu))。在這兩個不同的結(jié)構(gòu)域中，S1區(qū)結(jié)合受體細(xì)胞表面，目前已被確認(rèn)受體結(jié)合的功能區(qū)是在S蛋白N端31

3、8～510aa之間。 SARS是由一種新出現(xiàn)的冠狀病毒引起的，目前對SARS-CoV的致病機(jī)理和生物學(xué)特征等方面了解甚少。而S蛋白與病毒侵入人體過程關(guān)系密切，而且研究證明S蛋白的變異對SARS-CoV病毒株的毒力有很大影響，因此，克隆S蛋白尤其是S1區(qū)對SARS-CoV的生物學(xué)功能研究、血清流行病學(xué)調(diào)查以及研制基因工程備選疫苗均具有重要意義。制備抗S蛋白S1區(qū)單克隆抗體可能為SARS的特異性治療提供新的研究材料，同時也可在獲得S

4、蛋白單抗的基礎(chǔ)上建立SARS-CoV抗原檢測方法，為SARS早期診斷提供新方法。 本課題旨在原核克隆表達(dá)S蛋白S1區(qū)基因及其片段，并在獲得的具有免疫原性蛋白的基礎(chǔ)上免疫小鼠制備抗S蛋白鼠源性單克隆抗體，建立檢測S蛋白抗原的雙抗夾心ELISA法，研究制備的單抗和建立的抗原檢測方法對SARS治療和實(shí)驗(yàn)室診斷的作用；同時以具有免疫原性的重組蛋白為基礎(chǔ)初步建立SARS血清學(xué)診斷方法，比較研究該方法與其他SARS血清學(xué)診斷方法之間的優(yōu)劣，

5、探討S蛋白在SARS血清學(xué)診斷中的意義。 本研究主要分成三部分：第一部分S1基因片段的克隆、表達(dá)、純化及免疫原性鑒定：S蛋白的克隆是進(jìn)一步研究S蛋白功能、確定其抗原性以及制備抗S蛋白單抗的基礎(chǔ)。本部分研究是在獲得S蛋白S1區(qū)基因的基礎(chǔ)上，將S1區(qū)基因及其酶切片段克隆至原核表達(dá)載體中，為下一步的抗S蛋白單抗制備和建立血清學(xué)診斷方法提供材料。首先利用PCR技術(shù)擴(kuò)增SARS冠狀病毒S1區(qū)基因(HKU-39849，40～2001bp)，

6、將其定向插入pQE-30質(zhì)粒，在pQE-30質(zhì)粒上將S1進(jìn)行分段克隆(40～751、746～1344、746～2001bp)，成功獲得三種融合蛋白分別命名為S1a、S1b和S1c，表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)親和層析純化及WesternBlot和ELISA鑒定，首次證明了S1c(N端249-667氨基酸殘基，S蛋白與受體結(jié)合區(qū))蛋白與SARS患者的血清特異性結(jié)合，具有免疫原性。 第二部分抗S蛋白S1區(qū)N端249～667aa的單克隆抗體的制備和鑒定

7、：目前臨床上并無特異的抗SARS-CoV藥物，研究具有中和活性的單克隆抗體對SARS特異性的治療有重要意義，同時利用抗S蛋白單抗建立檢測S蛋白抗原的診斷方法也可為SARS的早期診斷提供新方法。本部分研究在第一部分成功獲得具有免疫原性的包含S蛋白受體結(jié)合區(qū)的S蛋白S1區(qū)片段的基礎(chǔ)上，制備抗S蛋白單抗并建立檢測S蛋白的診斷方法。首先將具有免疫原性的重組S1c蛋白免疫BALB/c小鼠，取脾臟與NS1骨髓瘤細(xì)胞融合后形成雜交瘤細(xì)胞株，用有限稀釋

8、法對多株單克隆細(xì)胞株進(jìn)行亞克隆化，經(jīng)S1c蛋白和全病毒裂解液篩選率先獲得了3株穩(wěn)定分泌S1區(qū)特異性單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株。3株單克隆抗體亞類測定顯示兩株為IgG2a，另一株為IgG1。WesternBlot和IFA鑒定該3株單克隆抗體具有高度的特異性，與其他兩株人冠狀病毒株229E和OC43無交叉反應(yīng)，親和力測定表明3株單抗均具有較高的親和力，親和常數(shù)分別為：9.96×10-8、1.62×10-0、8.45×10-9。通過相互競爭抑制

9、試驗(yàn)分析單抗識別抗原表位，結(jié)果顯示3株單克隆抗體識別2個不完全相同的抗原位點(diǎn)。根據(jù)單抗識別位點(diǎn)測定進(jìn)行抗體組合配對，用酶標(biāo)記每一株單抗，將每一株單抗分別與其它2株酶標(biāo)記單抗進(jìn)行相互配對實(shí)驗(yàn)，通過篩選獲得捕獲及檢測抗體最佳配對組合成雙抗夾心ELISA法，檢測S1c蛋白最低濃度為3ng/ml。 第三部分SARS患者血清中抗S1c蛋白特異性抗體研究：目前用于SARS血清學(xué)診斷的診斷試劑是在SARS-CoV全病毒裂解液的基礎(chǔ)上建立的，特

10、異性差、敏感度低、制備條件要求很高是其主要的缺點(diǎn)。研究重組SARS-CoV結(jié)構(gòu)蛋白建立的SARS血清學(xué)診斷方法在SARS診斷中的作用有重要意義，可為目前使用的SARS-CoV全病毒裂解液尋找可行的替代抗原。本部分研究以純化重組S1c蛋白作為抗原建立間接ELISA方法，分析SARS患者血清針對S蛋白特異性抗體的產(chǎn)生規(guī)律，同時與抗SARS-CoVN蛋白抗體和抗全病毒抗體進(jìn)行比較。檢測結(jié)果顯示：(1)抗S1c蛋白特異性抗體(S1c-IgG)的

11、陽性率隨著病程的延長而增高，其產(chǎn)生變化規(guī)律與全病毒抗體(SARS-CoVIgG)和抗N蛋白抗體(N-IgG)的產(chǎn)生變化規(guī)律一致。(2)S1c-IgG第1周檢出陽性率為5％(2/44)，第2周為39％(7/18)，第3周陽性率達(dá)到83％(20/24)；而SARS-CoVIgG在發(fā)病第1周檢出陽性率為14％(6/44)，第2周為56％(10/18)，第3周達(dá)100％(24/24)；N-IgG陽性率變化與SARS-CoVIgG一致。(3)S1

12、c蛋白的檢測結(jié)果分別與SARS-CoVIgG和N-IgG結(jié)果比較，檢測符合率分別為83％(71/86)和80％(69/86)。檢測健康人群的血清樣品，未發(fā)現(xiàn)抗S1c蛋白特異性抗體的陽性反應(yīng)，表明S1c蛋白具有高度的特異性，但免疫印跡和ELISA兩種方法檢均測到14例正常人群血清樣品N-IgG陽性，陽性率為1.88％(14/745)，說明S蛋白在血清學(xué)診斷中的特異性要比N蛋白高。 本研究的結(jié)果為S蛋白功能的進(jìn)一步研究、中和抗體的篩

13、選以及建立SARS實(shí)驗(yàn)室診斷新方法奠定了基礎(chǔ)，主要得出以下幾點(diǎn)結(jié)論： 1.構(gòu)建SARS-CoVS蛋白S1區(qū)基因的分段表達(dá)質(zhì)粒，并成功誘導(dǎo)表達(dá)和純化，率先獲得了具有免疫原性重組蛋白S1c，該重組蛋白包含了SARS-CoV病毒中和性抗體表位(310～512aa)，為制備抗病毒中和性單抗和建立SARS血清學(xué)診斷方法奠定基礎(chǔ)。 2.率先成功制備了3株SARS-CoVS1區(qū)特異性單克隆抗體，建立的雙抗夾心抗原捕捉ELISA法可敏感

14、地檢測到S1c蛋白，該研究為SARS-CoV生物學(xué)研究提供了一種特異性標(biāo)記分子，為篩選SARS-CoV病毒中和性單抗提供了備選單抗，也為SARS的早期診斷提供了一種新方法。 3.發(fā)現(xiàn)在SARS患者恢復(fù)期血清中，抗重組S1c蛋白IgG具有較高的陽性率，表明該蛋白具有較好的敏感度和特異性。證明了SARS-CoVS1c蛋白具有較強(qiáng)免疫原性，提示S蛋白可誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生有效的免疫應(yīng)答，檢測SARS-CoVS蛋白的特異性抗體，可用于SARS-