攜帶截短型SARS-CoV刺突蛋白S1亞單位重組腺病毒在大鼠體內(nèi)誘導的抗SARS-CoV免疫反應研究.pdf

1、研究背景和研究目的：嚴重急性的呼吸道綜合癥(severe acute respiratory syndrome，SARS)是一種由SARS病毒感染引起的突發(fā)性致命性疾病。發(fā)展有效而安全的SARS病毒疫苗是控制和預防SARS再次爆發(fā)的最好方法。SARS病毒滅活疫苗是最易制備的SARS疫苗，但滅活的全病毒疫苗存在著一些不安全的因素。研制SARS基因疫苗可能是一種更好的選擇。 S蛋白是SARS病毒的主要結構蛋白，由S1和S2兩個亞單位

2、構成。Sl負責識別和結合宿主細胞表面的受體，而S2介導病毒與細胞膜融合。采用可溶性SARS病毒受體或抗S1抗體均能通過干擾其與細胞受體的結合而阻斷病毒的有效感染。根據(jù)上述事實可以提出一個假設：如果設計一個疫苗干擾S蛋白與其受體的結合，那就可以阻止SARS病毒經(jīng)受體結合途徑傳播。非人類冠狀病毒疫苗的研究已證實冠狀病毒S1亞單位上存在誘導產(chǎn)生中和抗體的抗原表位，它誘導產(chǎn)生的中和抗體能保護動物免受相應病毒的感染。最近關于SARS病毒疫苗的研究

3、也證實表達S蛋白或其S1亞單位的基因疫苗能在多種動物模型中誘導高滴度的保護性中和抗體產(chǎn)生。然而Weingartl等報道用痘苗病毒表達全長S蛋白可在雪貂體內(nèi)快速誘導出有效的中和抗體反應，同時也增強了SARS病毒誘導的肝臟炎癥反應。 在本研究中，我們構建一個表達截短的S1亞單位片段(截短的S1亞單位，SN)的重組5型腺病毒Ad-S<,N>，研究其在大鼠體內(nèi)誘導的體液和細胞免疫反應，同時進行初步的安全性研究，希望能為研制出一種安全、有

4、效的SARS病毒疫苗打好基礎。 實驗方法: 1.重組腺病毒的構建 通過PCR擴增SARS病毒(SARS-CoV)刺突蛋白(Spike)N端基因片段(SN，-45nt～1469nt)。引物分別為5’-GGTCTAGAGTlTGTGGTTFCAAGTGAT-3’和5’-TAGGTACCAATGCCAGTAGTGGTG-3’。S<,N>片段通過．XbaI和KpnI位點克隆進pShuttle質(zhì)粒得到pShuttle-S<

5、,N>。所得質(zhì)粒采用PCR、限制性酶切和測序分析進行鑒定。 將pShuttle-S<,N>用I-CeuI和PI-SCeI酶切后，與pAdeno-X的I-CeuI/PI-SceI雙酶切片段直接連接，構建含SN表達框的重組腺病毒質(zhì)粒pAd-S<,N>。構建產(chǎn)物采用PCR法初步鑒定后，再用限制性酶切分析和測序鑒定。將pAd-S<,N>用PacI酶切使重組腺病毒DNA線性化后轉(zhuǎn)染至293細胞以獲得重組腺病毒Ad-S<,N>。重組腺病毒在

6、293細胞中擴增，經(jīng)CsCl密度梯度離心純化后，采用Adeno-X<'TM>快速滴度測定試劑盒測定滴度。通過PCR檢測S<,N>表達框架、重組腺病毒骨架(E2區(qū))對重組腺病毒進行鑒定，并檢測其中有無野生型腺病毒、無表達框架或無外源基因的重組腺病毒、腺相關病毒污染。通過限制性酶切分析鑒定Ad-S<,N>基因組的正確性。 Ad-Lacz和Ad-GFP分別為攜帶β-半乳糖苷酶基因和綠色熒光蛋白基因的重組5型腺病毒，是本實驗室按照同樣方

7、法構建的，在本研究中作為載體對照。 2.RT-PCR檢測S<,N>基因表達 用TRIZOL試劑抽提重組腺病毒感染的Vero-E6細胞或大鼠組織中的RNA，用無Rnase的DNase去除殘留的DNA后，將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后用SN特異的引物(5’-CGAGTACATATCTGATGCC-3’和5’-ACGCCATAGCACTTAAAGG-3’)進行PCR檢測S<,N> mRNA水平的表達，內(nèi)對照采用β-actin引物(

8、5’-CGTCTCCCCTCCATCGTG-3’和5’-CCCTCATAGATGGGCACAG-3’)。 3.Western blot分析 為了檢測S<,N>的表達及S<,N>與SARS患者血清和免疫大鼠抗血清的特異性結合反應，我們采用三種一抗：兔抗SARS刺突蛋白IgG、SARS患者康復期血清、免疫大鼠血清進行了Western blot分析。細胞裂解液、細胞培養(yǎng)上清和大鼠組織勻漿液用10﹪ SDS-PAGE分離

9、、轉(zhuǎn)移至PVDF膜上；PVDF膜封閉過夜后，依次與一抗(兔抗SARS刺突蛋白IgG、SARS患者康復期血清、免疫大鼠血清)、二抗(HRP偶聯(lián)的抗兔/人/大鼠IgG抗體)雜交，用LumiGLO<'TM>顯色液顯色(化學發(fā)光)，X光片曝光顯影。 4.免疫大鼠 Wistar大鼠(每組10只)分別用Ad-S<,N>(1×10<'7>pfu/(dose·rat))或?qū)φ?Ad-LacZ或PBS)通過鼻腔(i.n.)或皮下(S.C.

10、)免疫大鼠，大鼠分別于第0、7、14天各免疫一次，于第0、7、14和21天通過眼窩靜脈叢取血；第28天從腹主靜脈取血，并處死動物，取各主要組織和器官。 5.抗SARS-CoV抗體檢測 抗SARS-CoV IgG滴度用ELIsA法測定。SARS-CoV全抗原包被的96孔酶標板依次用2倍系列稀釋的大鼠血清、HRP偶聯(lián)的抗大鼠IgG抗體(二抗)孵育，加底物液顯色，用酶標儀測450nm吸光度OD<,450nm>(630nm作為對

11、照波長)；OD<,450nm>值高于陰性對照0.16的孔定位陽性，樣品陽性孔最高稀釋度為抗體的滴度。 6.抗SARS-CoV中和抗體檢測 免疫大鼠血清中和抗體活性用體外微孔中和分析法測定。2倍系列稀釋的熱滅活大鼠血清與100TCID50的SARS病毒混合后溫育1h后，加入種有Vero．E6細胞的96孔板中37℃培養(yǎng)3～4天，觀察細胞病變情況；每組實驗孔中60﹪以上(即5復孔中至少3個孔)細胞不出現(xiàn)病變的血清最高稀釋度為該

12、樣品的中和抗體滴度。 7.大鼠CTL活性檢測 免疫大鼠脾細胞勻漿、過濾、梯度離心、過尼龍毛柱獲得大鼠T細胞，用SARS病毒S蛋白抗原肽庫刺激48h后作為效應細胞，靶細胞為大鼠肝細胞BRL-pcDNA3.1(S<'->)和BRL-sarsS(S<'+>)，用乳酸脫氫酶釋放法檢測大鼠T細胞的殺傷效應。設置效應細胞自發(fā)釋放孔、靶細胞自發(fā)釋放孔、靶細胞最大釋放孔、體積校正對照孔、培養(yǎng)基背景孔等對照。測量490nm處的光吸收(OD

13、)值，按以下公式計算殺傷活性。殺傷活性(﹪)=[(OD<,殺傷孔>-OD<,培養(yǎng)基背景>)-(OD<,效應細胞自發(fā)釋放>-OD<,培養(yǎng)基背景>)-(OD<,靶細胞自發(fā)釋放>-OD<,培養(yǎng)基背景>)]/[(OD<,靶細胞最大釋放>-OD體積校正)-(OD<,靶細胞自發(fā)釋放>-OD<,培養(yǎng)基背景>)]×100 8.實驗大鼠組織學檢查 免疫大鼠于第28天處死，取各種主要臟器和組織(肺、肝、結腸、心臟、腦組織、脾臟、腎臟等)，用