SARS康復(fù)者SARS-CoV S和M抗原特異性細(xì)胞免疫反應(yīng)及免疫記憶的研究.pdf

1、嚴(yán)重急性呼吸綜合征(severeacuterespiratorysyndrome，SARS)，亦稱傳染性非典型肺炎，是一種新出現(xiàn)的傳染性疾病。自2002年11月份我國廣東省發(fā)生首例SARS患者以來至2003年7月，世界衛(wèi)生組織報(bào)告全世界共有33個(gè)國家和地區(qū)發(fā)生8098例疑似SARS病例，死亡774例，病死率為9.6％。該病傳播速度快，人群普遍易感和死亡率高，成為近幾十年來最為兇險(xiǎn)的傳染病，嚴(yán)重威脅著人類的健康。2003年4月16日，WH

2、O正式宣布引起SARS的病原體是一種全新的冠狀病毒，并命名為SARS冠狀病毒(SARScoronavirus，SARS-CoV)。 SARS-CoV主要編碼4種結(jié)構(gòu)蛋白：棘突蛋白(S)、包膜蛋白(E)、膜蛋白(M)及核衣殼蛋白(N)。其中，S蛋白是SARS-CoV最大的結(jié)構(gòu)蛋白。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，表達(dá)S蛋白的副流感病毒免疫倉鼠后能誘導(dǎo)產(chǎn)生中和抗體，并能有效保護(hù)動(dòng)物抵抗SARS-CoV的攻擊。因此S蛋白被認(rèn)為是發(fā)展SARS疫苗的首選抗

3、原。S蛋白包含4個(gè)結(jié)構(gòu)域：胞漿區(qū)、跨膜區(qū)、S1和S2。胞漿區(qū)和跨膜區(qū)所占比例較小，大部分是由S1和S2構(gòu)成的包膜外域。S1和S2分別介導(dǎo)病毒與宿主細(xì)胞受體的結(jié)合及病毒包膜與細(xì)胞膜的融合。Yang等證實(shí)截除部分胞漿區(qū)的SARS-CoVSDNA疫苗與截除全部跨膜區(qū)及胞漿區(qū)的SARS-CoVSDNA疫苗免疫小鼠后均能誘導(dǎo)保護(hù)性中和抗體的產(chǎn)生，提示S1和S2是S蛋白的主要功能區(qū)。 M蛋白由220aa組成，是SARS-CoV的重要跨膜糖蛋

4、白。M蛋白與S蛋白的結(jié)合，以及M蛋白與N蛋白的結(jié)合在SARS-CoV裝配、出芽過程中發(fā)揮著重要的作用。M蛋白包括3個(gè)結(jié)構(gòu)域：一個(gè)短的N末端(胞外區(qū))、跨膜區(qū)和一個(gè)較大的C末端(胞漿區(qū))。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，編碼SARS-CoVM蛋白的DNA疫苗不僅能誘導(dǎo)體液免疫反應(yīng)產(chǎn)生高水平的抗體，而且還可誘導(dǎo)產(chǎn)生強(qiáng)烈的Th1反應(yīng)和遲發(fā)型超敏反應(yīng)(DTH)。因此，M蛋白也被認(rèn)為是研發(fā)SARS亞單位疫苗的候選抗原蛋白。 SARS流行期間，沒有任何一種藥

5、物能抑制SARS-CoV在體內(nèi)的復(fù)制，提示免疫系統(tǒng)在機(jī)體抵御SARS-CoV感染過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。用滅活的SARS-CoV作為抗原，對(duì)SARS患者進(jìn)行了血清特異性IgG和IgM抗體的動(dòng)態(tài)觀察。發(fā)現(xiàn)出現(xiàn)癥狀第2周，SARS患者血清中可檢測(cè)到SARS-CoV特異性IgM和IgG抗體，IgG抗體在第4周達(dá)到高峰，且抗體滴度連續(xù)3個(gè)月維持在較高水平。且靜脈注射康復(fù)期SARS患者的血清能有效治療急性期SARS病人?？梢?，體液免疫在機(jī)體抵

6、抗SARS-CoV感染過程中發(fā)揮著一定的保護(hù)作用。以往研究表明，機(jī)體抗病毒感染最有效的武器是特異性細(xì)胞免疫反應(yīng)。 在SARS患者發(fā)病早期外周血中淋巴細(xì)胞的計(jì)數(shù)減少，CD4+和CD8+T細(xì)胞絕對(duì)值顯著下降，而且患者外周血T細(xì)胞亞群的計(jì)數(shù)與病情的嚴(yán)重程度密切相關(guān)。相反，SARS患者外周血中的B淋巴細(xì)胞在SARS的整個(gè)發(fā)病過程中基本保持不變或輕微升高。提示SARS-CoV攻擊的靶細(xì)胞似乎主要是T淋巴細(xì)胞。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，無論是治愈組還

7、是死亡組CD3+、CD4+、CD8+T細(xì)胞絕對(duì)值在發(fā)病初的15天內(nèi)均顯著降低。發(fā)病15天后治愈組CD3+、CD4+、CD8+細(xì)胞計(jì)數(shù)顯著上升并逐漸恢復(fù)至正常；而死亡組CD3+、CD4+、CD8+絕對(duì)值不但沒有恢復(fù)，反而呈進(jìn)行性下降趨勢(shì)。這些結(jié)果提示T細(xì)胞在SARS病情的演變過程中可能有重要的意義。但CD4+和CD8+T細(xì)胞的數(shù)量改變不能完全反應(yīng)機(jī)體對(duì)SARS-CoV的特異性細(xì)胞免疫應(yīng)答狀態(tài)。目前針對(duì)SARS-CoV感染者特異性細(xì)胞免疫應(yīng)

8、答的研究報(bào)道國內(nèi)外尚少。有學(xué)者對(duì)SARS-CoVS蛋白進(jìn)行了HLA-A2限制性CD8+T細(xì)胞表位鑒定工作，但亞洲人群中HLA-A2+者僅占50％，所以應(yīng)用Tetramer的方法只能檢測(cè)HLA-A2+SARS患者的特異性CD8+T細(xì)胞的免疫應(yīng)答，但不能反應(yīng)HLA-A2-SARS患者的特異性免疫功能和CD4+T細(xì)胞的免疫應(yīng)答狀態(tài)。 為此，我們研究了完全康復(fù)期SARS患者外周血CD4+和CD8+T細(xì)胞對(duì)SARS-CoVS和M抗原的特異

9、性細(xì)胞免疫反應(yīng)。首先，我們分離了外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMCs)，體外經(jīng)SARS-CoVS多肽混合物或M多肽混合物刺激后，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)、酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)試驗(yàn)(ELISpot)及流式細(xì)胞檢測(cè)技術(shù)(FACS)，分別從整體水平、單個(gè)細(xì)胞水平分析了完全康復(fù)期SARS患者外周血中SARS-CoV特異性T淋巴細(xì)胞反應(yīng)。本文第一部分的結(jié)果顯示，在無S抗原刺激的情況下，無論是完全康復(fù)期SARS患者還是健康人外周血中PBMCs幾乎不分泌I

10、FN-γ。當(dāng)SARS-CoVS多肽混合物刺激后，SARS康復(fù)期患者的PBMCs分泌大量的IFN-γ，并可檢測(cè)出高頻率的IFN-γ產(chǎn)生細(xì)胞。與健康人刺激組及康復(fù)期SARS患者未刺激組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，完全康復(fù)期SARS患者外周血中存在較高頻率的SARS-CoVS抗原特異性記憶性T淋巴細(xì)胞。FACS結(jié)果進(jìn)一步顯示，完全康復(fù)期SARS患者外周血中的CD4+和CD8+T細(xì)胞經(jīng)SARS-CoVS多肽刺激

11、后可迅速產(chǎn)生IFN-γ。根據(jù)IFN-γ和IL-2的表達(dá)與否，CD4+T細(xì)胞可分為3個(gè)亞群：IFN-γ-IL-2+，IFN-γ+IL-2+和IFN-γ+IL-2-。表型分析顯示，SARS-CoVS抗原特異性記憶CD4+T細(xì)胞為CD45RO+CCR7+CD62L-，屬于中央型記憶細(xì)胞。相反，絕大部分的SARS-CoVS抗原特異性CD8+T細(xì)胞屬于效應(yīng)型記憶細(xì)胞，表型為CD45RO-CCR7-CD62L-。 本文的第二部分，我們?cè)诳祻?fù)

12、期SARS患者外周血中也檢測(cè)到較高頻率的SARS-CoVM抗原特異性記憶CD4+和CD8+T細(xì)胞。此外，我們還從SARS-CoVM蛋白中鑒定出4個(gè)主要的T細(xì)胞優(yōu)勢(shì)表位肽：p21～44，p65～91，p117～140及p200～220。且用這4個(gè)多肽刺激完全康復(fù)期SARS患者PBMCs，外周血中CD4+和CD8+T細(xì)胞均可產(chǎn)生IFN-γ，但以CD8+T細(xì)胞反應(yīng)為主。 綜上所述，本研究證實(shí)了SARS-CoVS蛋白和M蛋白的免疫原性。