SARS-CoV M蛋白編碼基因的克隆及其在粟酒裂殖酵母中的表達(dá).pdf

1、SARS冠狀病毒(SARS-CoV)感染引起嚴(yán)重急性呼吸綜合癥(SARS)。2003年冬春之際，SARS在我國以及世界上多個國家和地區(qū)爆發(fā)流行，對人類健康、經(jīng)濟(jì)發(fā)展和社會穩(wěn)定造成了嚴(yán)重的危害。世界衛(wèi)生組織曾發(fā)出警告：SARS是進(jìn)入21世紀(jì)，嚴(yán)重威脅人類健康的疾病，是繼艾滋病后，第二個能引起全球流行的新發(fā)傳染病，這受到全世界廣泛的關(guān)注，世界各國專業(yè)人士認(rèn)為研制SARS疫苗是預(yù)防和控制SARS的關(guān)鍵。 SARS-CoV是一種單股正鏈

2、RNA病毒，長約29,727個核苷酸，在rep基因下游有四個主要的開放閱讀框，編碼S、E、M和N這四個所有冠狀病毒都具有的結(jié)構(gòu)蛋白。M蛋白是SARS-CoV的一種重要的結(jié)構(gòu)蛋白，在己知的冠狀病毒的結(jié)構(gòu)蛋白中它的含量是最豐富的，最主要的是它能引起宿主產(chǎn)生中和抗體。另外，M蛋白和病毒的出芽和裝配有關(guān)。M蛋白含有高度保守的糖基化序列，而且它的糖基化可能與病毒和宿主的相互作用有關(guān)。由于M蛋白在冠狀病毒的生命周期中具有重要作用，而且它有免疫原性，

3、這使它成為抗SARS藥物研究、疫苗研發(fā)和血清學(xué)診斷方法的確立過程中非常有吸引力的靶標(biāo)。該項研究利用基因重組技術(shù)，將SARS-CoVM蛋白編碼基因通過裂殖酵母附加型載體在裂殖酵母TCP1中表達(dá)，構(gòu)建了胞內(nèi)表達(dá)SARS-CoVM蛋白的基因工程菌。 首先設(shè)計特異性的引物利用RT-PCR技術(shù)，以SARS-CoV總RNA為模板體外擴(kuò)增出SARS-CoVM蛋白編碼基因。然后就將擴(kuò)增得到的目的片段連接pMD18-T載體進(jìn)行測序。將測序結(jié)果進(jìn)行

4、序列分析，與GeneBank中的SARS-CoVM序列進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)此編碼基因的序列與SARS-CoV很多菌株的M基因幾乎是100％同源。設(shè)計帶有Kozak序列的引物對驗證測序正確的pMD18-T-M進(jìn)行擴(kuò)增得到目的基因，選擇帶有標(biāo)記的表達(dá)載體，將目的基因TOPO克隆進(jìn)表達(dá)載體的克隆位點，使其融合于載體中的V5多肽和6×His多肽的上游，可利用它們進(jìn)行產(chǎn)物的分離、純化和檢測。經(jīng)過PCR鑒定后，構(gòu)建得到重組酵母表達(dá)載體。將重組表達(dá)載體pN

5、MT1-M用電轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化裂殖酵母TCP1，重組載體含有ars1，因而能在酵母中自主復(fù)制。在含有硫胺素的亮氨酸營養(yǎng)缺陷型平板EMM上篩選重組轉(zhuǎn)化子，通過菌落PCR法進(jìn)行初步鑒定。然后將初步篩選出來的重組子提取酵母質(zhì)粒并通過PCR的方法進(jìn)行鑒定。最終篩選得到含有重組質(zhì)粒pNMT1-M的酵母轉(zhuǎn)化子。 對重組酵母進(jìn)行特性研究，發(fā)現(xiàn)重組酵母的質(zhì)粒穩(wěn)定性很高；根據(jù)宿主菌和重組菌在不同生長時期培養(yǎng)液中的細(xì)胞密度(OD值)繪制它們的生長曲線圖，

6、分析兩者生長規(guī)律，結(jié)果表明兩者并無太大差別。說明外源基因的導(dǎo)入對宿主酵母的生長無明顯干擾。將重組菌液體搖瓶培養(yǎng)并去硫胺誘導(dǎo)表達(dá)外源蛋白，經(jīng)誘導(dǎo)16h左右后離心收集菌體，玻珠法破壁提取蛋白后進(jìn)行SDS-PAGE分析，再通過Westernblot進(jìn)一步鑒定，結(jié)果確定了重組菌培養(yǎng)液能夠表達(dá)SARS-CoVM蛋白。 該項研究建立的裂殖酵母表達(dá)系統(tǒng)能夠有效的表達(dá)下游標(biāo)記V5和6×His多肽的重組SARS-CoVM蛋白，為SARS疫苗研究提