粟酒裂殖酵母必需基因省略抑制子的系統(tǒng)篩選和機(jī)制研究.pdf

1、本文主要從以下幾個(gè)方面進(jìn)行論述：
　　第一部分 通過篩選過表達(dá)省略抑制子研究粟酒裂殖酵母Schizosaccharomyces pombe必需基因缺失的可彌補(bǔ)性
　　在單細(xì)胞物種中，必需基因可被簡(jiǎn)單定義為在正常培養(yǎng)條件下對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)所必需的基因。因此必需基因?？刂萍?xì)胞內(nèi)核心的生物學(xué)過程，也在不同物種間具有很高的保守性[1]。功能基因組學(xué)的研究表明，有些基因在不同的物種間顯示出不同的必需性[2]，這表明基因的必需性受遺傳環(huán)境影響

2、。遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)還曾發(fā)現(xiàn)某些必需基因缺失造成的致死表型可以被單個(gè)突變所挽救，這種突變被稱為省略抑制子。為系統(tǒng)研究省略抑制現(xiàn)象，我們?cè)谒诰屏阎辰湍窼.pombe中對(duì)其Ⅱ號(hào)染色體左臂的165個(gè)必需基因開展了省略抑制子篩選。
　　在本課題中，我們通過覆蓋幾乎整個(gè)基因組的過表達(dá)質(zhì)粒文庫觀察單個(gè)基因的過表達(dá)對(duì)必需基因缺失的彌補(bǔ)性影響。我們首先在S.pombe中建立了一套可靠的篩選過表達(dá)省略抑制子(overexpression-mediated

3、bypass-of-essent ial-gene(O-BOE) suppressors）的方法，并成功對(duì)128個(gè)必需基因進(jìn)行了O-BOE的篩選以及鑒定。
　　通過我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們發(fā)現(xiàn)在S.pombe的基因組中，約12.5％的必需基因缺失的致死表型能被單個(gè)過表達(dá)質(zhì)粒所挽救（省略抑制）。而大部分必需基因都篩選不到過表達(dá)省略抑制子，這表明細(xì)胞內(nèi)的必需基因不是同等重要的。通過分析我們發(fā)現(xiàn)有O-BOE抑制子的必需基因與沒有O-BOE抑

4、制子的必需基因相比，基因的進(jìn)化速率更快，在不同物種間的保守性更低。同時(shí)，在蛋白質(zhì)相互作用的網(wǎng)絡(luò)中，這些基因也不傾向成為網(wǎng)絡(luò)中的中心，和形成聚集的模塊。這表明這些可被省略抑制的必需基因，在特征上更接近非必需基因。
　　通過分析過表達(dá)省略抑制相互作用的模式，我們發(fā)現(xiàn)編碼同一個(gè)蛋白復(fù)合體中不同蛋白的必需基因，或者在相同生物學(xué)通路中起作用的必需基因的過表達(dá)省略抑制子之間會(huì)出現(xiàn)交集，這表明系統(tǒng)性的省略抑制子研究有可能幫助我們找到必需基因相互

5、作用的模塊。而我們進(jìn)一步的分析表明，過表達(dá)省略抑制遺傳相互作用有助于揭示基因的必需生物學(xué)功能，如res1可被Cdc18過表達(dá)省略抑制，這表明res1的必需功能可能是在細(xì)胞周期的G1/S轉(zhuǎn)變過程中激活Cdc18的轉(zhuǎn)錄;同時(shí)我們發(fā)現(xiàn)多個(gè)磷脂酶的過表達(dá)可以省略抑制ERMES(ER-mitochondria encounter site)復(fù)合體中的基因，這意味著ERMES復(fù)合體的必需功能與脂質(zhì)的調(diào)控有關(guān);同時(shí)過表達(dá)省略抑制相互作用可將不同的生物

6、學(xué)過程之間建立聯(lián)系，比如線粒體核糖體亞基mrp21與mrps28的缺失可被參與小分子RNA代謝過程的Dcr1省略抑制提示線粒體功能與小分子RNA之間可能存在聯(lián)系。這些例子表明過表達(dá)省略抑制相互作用不僅可以揭示細(xì)胞內(nèi)不同生物學(xué)過程之間的關(guān)系、發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)的必需功能模塊，同時(shí)也為我們研究必需基因在細(xì)胞內(nèi)的功能提供有價(jià)值的線索。
　　第二部分 探索SUMO靶向泛素連接酶Slx8-Rfp1/Rfp2在粟酒裂殖酵母中的必需功能
　　SU

7、MO靶向泛素連接酶(STUbL)是一類從單細(xì)胞酵母至人中結(jié)構(gòu)與功能都非常保守的蛋白。這類酶的存在表明細(xì)胞內(nèi)被SUMO修飾的蛋白可能會(huì)被蛋白酶體降解。在酵母S.cerevisiae以及人細(xì)胞中，STUbL調(diào)節(jié)的一些底物已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)，但細(xì)胞內(nèi)SUMO與泛素(ubiquitin)之間的這種交互對(duì)話的生物學(xué)意義以及STUbL家族主要在細(xì)胞內(nèi)調(diào)控的生物學(xué)過程仍舊不清楚。
　　在粟酒裂殖酵母S.pombe中，STUbL的功能由復(fù)合體Slx8-R

8、fp1/Rfp2實(shí)現(xiàn)，且STUbL的功能對(duì)于S.pombe細(xì)胞的生長(zhǎng)是必需的。必需基因通常調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)非常基礎(chǔ)核心的生物學(xué)過程，因此研究Slx8的必需功能不僅可幫助我們認(rèn)識(shí)STUbL在S.pombe中的作用機(jī)理，也可能幫助我們理解整個(gè)STUbL家族蛋白主要調(diào)控的生物學(xué)過程。
　　我們通過piggyBac(PB)轉(zhuǎn)座子以及酵母的過表達(dá)文庫對(duì)必需基因的省略抑制子篩選發(fā)現(xiàn)Slx8的缺失造成的致死表型可被多個(gè)基因的功能缺失或過表達(dá)挽救。我們

9、著重通過轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的省略抑制子(T-BOE)對(duì)Slx8的必需功能進(jìn)行了機(jī)理的研究。我們發(fā)現(xiàn)Slx8的必需功能與細(xì)胞內(nèi)被SUMO修飾的蛋白有關(guān)，突變參與SUMO修飾過程的基因(pli1⊿、fub2_C_ins)可顯著降低細(xì)胞內(nèi)整體水平的SUMO修飾而省略抑制Slx8的必需功能。Slx8的必需功能與核孔復(fù)合體以及Ulp1之間也存在著密切相關(guān)性:核孔蛋白Nup132的缺失、Nup189 C端氨基酸的缺失，以及去SUMO修飾蛋白酶Ulp2的缺失

10、均可省略抑制Slx8的必需功能，同時(shí)這些突變也影響去SUMO修飾蛋白酶Ulp1在核膜上的定位。我們的實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步表明，這些突變可能通過影響Ulp1蛋白在核膜上的定位而省略抑制Slx8的必需功能。
　　T-BOE實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)一個(gè)功能不明確的蛋白R(shí)rp2的缺失也可省略抑制Slx8的必需功能。我們通過進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)該蛋白的SUMO結(jié)合序列SIM對(duì)于其在slx8突變體中發(fā)揮生長(zhǎng)抑制作用（毒性）有非常重要的作用，這表明Rrp2蛋白可能與被SUM