粟酒裂殖酵母Trz2參與線粒體RNA加工和細(xì)胞凋亡的功能研究.pdf

1、線粒體是真核生物細(xì)胞中一種重要的細(xì)胞器。最近的研究表明，線粒體的功能失調(diào)與多種疾病相關(guān)，如艾滋病、神經(jīng)退行性疾病和癌癥。粟酒裂殖酵母是一種優(yōu)秀的研究線粒體遺傳學(xué)和分子生物學(xué)的模式生物，并為研究各種細(xì)胞器和核-線粒體的相互作用提供了一個(gè)良好的載體。
　　本研究利用改進(jìn)的蔗糖梯度離心方法純化了粟酒裂殖酵母線粒體，采取不去除小片段的方法提取了包括tRNA和小RNA在內(nèi)的所有線粒體RNA，并且通過透射電鏡和定量PCR驗(yàn)證了線粒體RNA的質(zhì)

2、量和純度。結(jié)合高通量測(cè)序和傳統(tǒng)的生物學(xué)實(shí)驗(yàn)方法，我們對(duì)粟酒裂殖酵母的線粒體轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行了全面分析。線粒體轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果顯示的RNAs的切割位點(diǎn)和基因的表達(dá)量差異表明轉(zhuǎn)錄后調(diào)控機(jī)制的存在。我們確定了rnl、atp6和tRNAAsn的切割位點(diǎn)，并通過CR-RT-PCR驗(yàn)證了測(cè)序數(shù)據(jù)的可信度。trz2與人的tRNase ZL(ELAC2)高度同源，而ELAC2基因與前列腺癌及艾滋病相關(guān)。Trz2定位在線粒體，具有tRNA3味端加工酶活性。全面分

3、析了Trz2失活對(duì)線粒體RNA加工和表達(dá)的影響，結(jié)果表明Trz2對(duì)于線粒體tRNAs的3'端的加工是必不可少的，并且Trz2的功能缺失也影響了線粒體mRNAs和rRNAs5'端成熟體的加工。線粒體是調(diào)控細(xì)胞凋亡的核心細(xì)胞器。我們發(fā)現(xiàn)高表達(dá)Trz2導(dǎo)致酵母細(xì)胞出現(xiàn)凋亡現(xiàn)象:DAPI染色發(fā)現(xiàn)高表達(dá)Trz2導(dǎo)致粟酒裂殖酵母出現(xiàn)細(xì)胞核破碎和染色質(zhì)凝聚;Annexin-Ⅴ標(biāo)記表明高表達(dá)Trz2引起細(xì)胞膜磷酯酰絲氨酸外翻，并且定量PCR發(fā)現(xiàn)線粒體凋

4、亡激活因子aif1表達(dá)上調(diào);線粒體熒光染料MitoTracker染色發(fā)現(xiàn)OETrz2菌株的線粒體發(fā)生斷裂，并且通過羅丹明123染色發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)累積了大量的活性氧。高表達(dá)Trz2引起的細(xì)胞凋亡依賴其線粒體定位。在國內(nèi)外的研究中尚未有Trz2調(diào)控細(xì)胞凋亡的相關(guān)報(bào)道。粟酒裂殖酵母是一種優(yōu)秀的模式生物，許多重要生物過程與人接近。因此，本文章希望通過利用裂殖酵母為模型研究Trz2調(diào)控的線粒體介導(dǎo)的凋亡，本研究為了解tRNase ZL及凋亡相關(guān)疾病的