粟酒裂殖酵母snR88和U18snoRNA的功能分析.pdf

1、核仁小分子RNA(smaU nucleoar RNA，snoRNA)是一類(lèi)代謝穩(wěn)定、特征鮮明、具有重要功能的非編碼RNA(non-coding RNA)。根據(jù)其保守的序列元件和二級(jí)結(jié)構(gòu)，snoRNA分為boxC/D和boxH/ACA兩大家族。這兩種類(lèi)型的snoRNA，除少數(shù)參與pre-rRNA的剪切加工外，大多數(shù)負(fù)責(zé)指導(dǎo)rRNA或snRNA在進(jìn)化上高度保守區(qū)域的2’-O-核糖甲基化和假尿嘧啶化修飾。通過(guò)不同的實(shí)驗(yàn)RNA組學(xué)和計(jì)算機(jī)RNA

2、組學(xué)方法，已在多種模式生物中如酵母、水稻、果蠅、人以及古細(xì)菌等進(jìn)行了大規(guī)模的snoRNA鑒定與分析。隨著研究的不斷深入，snoRNA日益呈現(xiàn)出許多結(jié)構(gòu)與功能的新特點(diǎn)。粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)是研究真核生物分子生物學(xué)良好的模式生物之一，其主要優(yōu)勢(shì)在于能夠進(jìn)行簡(jiǎn)便、高效的基因敲除，這對(duì)于深入研究snoRNA的功能提供了極大的便利。本文通過(guò)敲除粟酒裂殖酵母的snR88和U18兩個(gè)bOX C/D snoR

3、NA，主要獲得了如下研究結(jié)果： 通過(guò)篩選本實(shí)驗(yàn)室先前建立的粟酒裂殖酵母小分子RNA的cDNA文庫(kù)，一個(gè)長(zhǎng)84nt的新的box C/D snoRNA被鑒定出來(lái)，命名為snR88。snR88的保守元件box C有較大變異，這可能是計(jì)算機(jī)分析難以將其搜索到的主要原因。snR88有兩條反義序列，是粟酒裂殖酵母中為數(shù)不多的雙引導(dǎo)(double guide)snoRNA之一，預(yù)測(cè)其指導(dǎo)粟酒裂殖酵母25S-rRNA U2304和U2497兩個(gè)

4、位點(diǎn)的2’-O-核糖甲基化修飾。snR88基因位于粟酒裂殖酵母Ⅰ號(hào)染色體上的基因間隔區(qū)，生物信息學(xué)分析顯示其不是由內(nèi)含子編碼，也不屬于基因簇。利用同源重組技術(shù)，snR88基因編碼區(qū)上游的啟動(dòng)子元件TATA box被敲除，這導(dǎo)致snR88的表達(dá)被完全抑制，證明它是一個(gè)獨(dú)立編碼基因。在用低濃度dNTP法檢測(cè)snR88所指導(dǎo)修飾的甲基化位點(diǎn)時(shí)發(fā)現(xiàn)，Um2497能夠產(chǎn)生三條逆轉(zhuǎn)錄停頓帶；我們用堿水解法進(jìn)一步證實(shí)這三條逆轉(zhuǎn)錄帶實(shí)際來(lái)自于Um249

5、7一個(gè)位點(diǎn)的甲基化，并推測(cè)此處的甲基化修飾對(duì)核糖體RNA的高級(jí)結(jié)構(gòu)有重要影響。釀酒酵母中的U24，U18，snR13和snR52四個(gè)box C/D snoRNA具有異常修飾功能，即除了能指導(dǎo)靶分子第五位核苷酸的甲基化修飾外，還能指導(dǎo)相鄰的第六位核苷酸的甲基化修飾。在粟酒裂殖酵母中成功地將U18敲除，結(jié)果發(fā)現(xiàn)作為釀酒酵母U18的同源分子，粟酒裂殖酵母的U18 snoRNA并不具備異常修飾功能，僅指導(dǎo)25S-rRNA A674一個(gè)核苷酸的甲

6、基化修飾。我們分析了九個(gè)物種U18 snoRNA的結(jié)構(gòu)特征，發(fā)現(xiàn)U18在各個(gè)物種中高度保守，保守元件和功能序列變異極小。進(jìn)一步分析釀酒酵母和粟酒裂殖酵母U18同源分子的特點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)粟酒裂殖酵母的U18靠近boxD’的核苷酸不能像釀酒酵母的U18一樣形成“bulge”結(jié)構(gòu)，這可以作為“bulge”假說(shuō)的一個(gè)佐證。通過(guò)比較分析U18的同源分子在不同物種中的作用，對(duì)于深入揭示box C/D snoRNA功能發(fā)揮過(guò)程的機(jī)理具有重要意義。

7、采用細(xì)胞密度梯度稀釋法，我們調(diào)查了snoRNA基因的缺失對(duì)酵母生長(zhǎng)的影響。在37℃、抗生素G418存在時(shí)，U18的特異缺失株能夠生長(zhǎng)，U18的非特異缺失株則死亡；U18和Z16的非特異缺失株，在37℃、抗生素G418存在時(shí)均能生長(zhǎng)，U18和snR88的特異缺失株則不能生長(zhǎng)；U18和snR88的特異缺失株在30℃、抗生素G418存在時(shí)，都能生長(zhǎng)，但是snR88缺失株的生長(zhǎng)速度明顯比U18缺失株的生長(zhǎng)速度慢。這些現(xiàn)象說(shuō)明，不同snoRNA基

8、因的缺失，對(duì)酵母生長(zhǎng)的影響程度不同；在環(huán)境溫度較高(37℃)、有抗生素(G418)存在時(shí)，核糖體RNA的2’-O-甲基化對(duì)維持酵母的生長(zhǎng)有重要作用。通過(guò)分析多個(gè)物種box C/D snoRNA的功能序列發(fā)現(xiàn)，近半數(shù)box C/DsnoRNA的反義序列與其臨近的box D/D’相隔一個(gè)堿基，而且這個(gè)相隔堿基的組成有強(qiáng)烈的偏好性，以A和U為主，約占70～80﹪，植物中則高達(dá)90﹪。結(jié)合已有的研究成果，我們認(rèn)為這種堿基組成偏好性可能是生物為了