表皮葡萄球菌雙組分信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)arlS等組氨酸激酶編碼基因的功能初步研究.pdf

1、表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)是寄居于人體皮膚表面常見的一種條件致病菌，通常并不致病。然而，隨著各種人工醫(yī)療材料(如人工瓣膜、靜脈留置管和導(dǎo)尿管等)的普遍使用，表皮葡萄球菌已成為引起醫(yī)院內(nèi)感染主要致病菌之一。表皮葡萄球菌能在醫(yī)療植入材料表面形成生物被膜(Biofilm)樣結(jié)構(gòu)，而該結(jié)構(gòu)具有抵抗抗生素治療和宿主免疫系統(tǒng)的作用，從而導(dǎo)致耐藥株產(chǎn)生及慢性感染。 細(xì)菌能夠生存的首要前提是適應(yīng)外界環(huán)境

2、，因此細(xì)菌必須具有感應(yīng)外界環(huán)境信號(hào)的能力，并迅速將信號(hào)傳入菌體內(nèi)，從而啟動(dòng)一系列相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄、表達(dá)以及表達(dá)產(chǎn)物的修飾，發(fā)揮相應(yīng)的生物學(xué)功能。大多原核生物利用雙組分信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)(Two-component Signal Fransduction Systems,TCSs)的機(jī)制進(jìn)行信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，調(diào)控其生物學(xué)特性。TCSs由組氨酸激酶(Histidine Kinase，HK)蛋白和反應(yīng)調(diào)節(jié)．蛋白(Response Regulator，RR)組

3、成，HK含有2個(gè)功能域，即HATPase_c和HisKA功能域。當(dāng)外界信號(hào)作用于組氨酸激酶蛋白的膜外配體結(jié)合區(qū)時(shí)，激活激酶的ATP結(jié)合部位(HATPase_c domain)，HATPase_c功能域可結(jié)合、水解ATP為ADP，并將ATP的磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移到激酶HisKA功能域的組氨酸位點(diǎn)，使其發(fā)生自身磷酸化。隨后，反應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白調(diào)控區(qū)域能與磷酸化的組氨酸蛋白激酶相互作用，將激酶上的磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移到自身天冬氨酸位點(diǎn)上，發(fā)生自身磷酸化，并能激活效

4、應(yīng)區(qū)，使其構(gòu)像改變，暴露不同DNA結(jié)合位點(diǎn)，結(jié)合不同DNA序列產(chǎn)生一系列調(diào)控反應(yīng)。 TCSs廣泛存在于革蘭陽性菌和革蘭陰性菌中，其不僅參與細(xì)菌的基本生命活動(dòng)，目前也發(fā)現(xiàn)它與很多病原菌的毒力和致病性密切相關(guān)。TCSs在表皮葡萄球菌中的研究還知之甚少，故本論文旨在探討表皮葡萄球菌的TCSs在其生物學(xué)功能中的作用。 一．表皮葡萄球菌雙組分信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)ariS基因的功能研究在金黃色葡萄球菌中研究發(fā)現(xiàn)arlS與細(xì)菌許多生物學(xué)功能有

5、關(guān)，而其在表皮葡萄球菌中的生物學(xué)功能尚無報(bào)道。為了探討表皮葡萄球菌arlS/R雙組分信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)的組氨酸激酶蛋白arlS基因刪除對(duì)細(xì)菌生物學(xué)功能的影響，我們構(gòu)建了含有紅霉素抗性基因(ErmB)的arlS刪除質(zhì)粒pBT2-AarlS，隨后將電轉(zhuǎn)入表皮葡萄球菌1457菌株的重組質(zhì)粒在43℃條件下振搖培養(yǎng)，篩選arlS缺失突變株，并對(duì)獲得的刪除突變株進(jìn)行PCR、測序及生物化學(xué)反應(yīng)試劑條鑒定，確證為表皮葡萄球菌1457 arlS缺失突變株(SE

6、1457-△arlS)。 為觀察arlS刪除對(duì)細(xì)菌生物膜形成的影響，我們采用細(xì)菌生物膜微量板半定量方法檢測arlS刪除突變對(duì)細(xì)菌生物被膜形成的影響，結(jié)果表明SEl457-△arlS株形成生物被膜的能力明顯低于野生株，降低90.96％。細(xì)菌初始黏附實(shí)驗(yàn)檢測野生株和SE1457-△arlS株黏附到多聚物材料表面的能力，結(jié)果表明野生株和SE1457-△arlS株黏附到多聚物表面的能力沒有差異，野生株黏附在多聚物表面的細(xì)菌數(shù)為3.64

7、x 104/cm2，SE1457-△arlS株的細(xì)菌數(shù)為3.58 x 104/cm2。通過檢測OD570值觀察其生長情況，結(jié)果顯示SE1457-△arlS株與野生株的生長曲線相似，arlS基因刪除對(duì)細(xì)菌增殖無明顯影響。為檢測arlS基因刪除對(duì)菌細(xì)胞裂解酶活性的影響，用SE1457-△arlS株和野生株的過夜培養(yǎng)上清液與靶細(xì)菌共孵育，結(jié)果表明SE1457-△arlS株過夜培養(yǎng)上清液對(duì)靶細(xì)菌裂解的活性低于野生株，其裂解率為20.50％，野生

8、株為56.12％。進(jìn)而采用0.1％Triton X-100誘導(dǎo)細(xì)菌自溶的方法檢測SE1457-△arlS株和野生株自溶的差異，結(jié)果顯示SE1457-△arlS株的裂解率為97.83％，野生株為55.38％，刪除突變株自溶率高于野生株。 二．表皮葡萄球菌雙組分信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)ArlS、VraS、SaeS、SrrB、LrtS及YyeG組氨酸激酶蛋白功能域的表達(dá)和純化因TCSs在細(xì)菌感受外界信號(hào)刺激并傳遞信號(hào)過程中起關(guān)鍵作用，組氨酸激酶H

9、ATPase c和HisKA功能域是其活化所必需，故我們?cè)噲D得到功能域的晶體結(jié)構(gòu)并分析結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系。根據(jù)表皮葡萄球菌ATCC35984株基因組序列找到上述基因及其蛋白序列，把蛋白序列在SMART和Pfam數(shù)據(jù)庫進(jìn)行分析。為表達(dá)表皮葡萄球菌TCSs的．ArlS、VraS、SaeS、SrrB、LytS和YycG組氨酸激酶蛋白功能域，分別使用pet22b和pGEX-4T-1做為表達(dá)載體，表明在pGEX-4T-1中蛋白能夠大量表達(dá)，但僅Vr