番茄果實(shí)乙烯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)組分EREBPs基因克隆和表達(dá)研究.pdf

1、乙烯對植物的生長發(fā)育起重要的調(diào)控作用,隨著乙烯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)研究的不斷深入,許多乙烯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)組分已被分離和鑒定,并在模式植物擬南芥中已建立乙烯信號(hào)傳遞過程中的核內(nèi)級(jí)聯(lián)反應(yīng):EIN3→ERF1(EREBPs)→病原相關(guān)蛋白,但在番茄中還沒有建立EIN3→EREBPs→果實(shí)成熟相關(guān)基因的相似路徑.EREBPs(乙烯反應(yīng)元件結(jié)合蛋白)是一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子家族,通過與乙烯調(diào)節(jié)的目標(biāo)基因的啟動(dòng)子區(qū)結(jié)合而調(diào)節(jié)目標(biāo)基因的表達(dá).番茄是研究果實(shí)成熟的模式植物,對番茄

2、EREBPs基因的研究,將使我們對乙烯調(diào)控果實(shí)成熟相關(guān)基因表達(dá)的機(jī)制更加明確,進(jìn)一步豐富和完善乙烯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)理論.該課題根據(jù)GenBank中的擬南芥、煙草、番茄EREBPs家族成員的序列比較,在保守區(qū)(ERF結(jié)構(gòu)域)設(shè)計(jì)簡并引物(degenerate primer),以破色期普通番茄果實(shí)RNA為模板,進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增,獲得114 bp的同源片段,以此片段為探針篩選破色期普通番茄果實(shí)cDNA噬菌體文庫,獲得兩個(gè)包含全長編碼區(qū)的陽性克隆.

3、序列分析表明這兩個(gè)基因都屬于EREBPs家族,依次命名為LeERF1、LeERF2.LeERF1 cDNA為1041 bp,開放閱讀框編碼204個(gè)氨基酸;LeERF2 cDNA為2898bp,開放閱讀框編碼210個(gè)氨基酸.LeERF1與EREBP4、DDTFR10/A在氨基酸水平上的序列相似性為33％,LeERF2與EREBP3、pti5在氨基酸水平上的序列相似性為46％,是新的基因.LeERF1、LeERF2的核酸序列已在GenBan

4、k登錄,登錄號(hào)分別為AY077626、AY275554.Northern雜交分析表明:LeERF1、LeERF2、pti4(已發(fā)表的番茄EREBPs成員)基因在普通番茄果實(shí)的成熟過程及果實(shí)的不同部位都有差異表達(dá),表現(xiàn)出與成熟進(jìn)程的相關(guān)性.在轉(zhuǎn)反義ACS和Nr番茄果實(shí)中,LeERF1、LeERF2、pti4基因表達(dá)總體水平上比普通番茄中的低,但仍然表現(xiàn)出與成熟進(jìn)程的相關(guān)性.乙烯處理(100μl/L)綠熟期普通番茄果實(shí)0.5h后,LeERF

5、1、LeERF2基因表達(dá)明顯增強(qiáng),pti4基因在乙烯處理后12h表達(dá)增強(qiáng);而用乙烯受體抑制劑1-MCP(1μl/L)處理普通番茄破色期果實(shí)10h后,LeERF1、LeERF2、pti4基因表達(dá)都受到了抑制,表明LeERF1、LeERF2、pti4基因表達(dá)受到乙烯的正調(diào)控.激素和化學(xué)試劑處理結(jié)果表明:0.1mM ABA處理綠熟期普通番茄果實(shí)8h后,乙烯生成增加,LeERF1、LeERF2基因表達(dá)增強(qiáng);1mM SA處理綠熟期普通番茄果實(shí)8h

6、后,乙烯的生成稍有抑制,LeERF1基因表達(dá)受到抑制,LeERF2基因表達(dá)與對照基本相近;而ABA和SA處理對pti4基因的表達(dá)沒有影響,表明果實(shí)中pti4基因表達(dá)不受ABA和SA的誘導(dǎo).0.1mM ABA處理番茄幼苗,隨著處理時(shí)間的延長,LeERF1、LeERF2、pti4基因表達(dá)都逐漸增強(qiáng);1mM SA處理番茄幼苗0.5h后,LeERF1、LeERF2、pti4基因表達(dá)明顯增強(qiáng),然后隨著處理時(shí)間的延長逐漸下降,表明ABA和SA對Le