表皮葡萄球菌色氨酰tRNA合成酶和ArlRS雙組分信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)作為抗菌靶標(biāo)的研究.pdf

1、凝固酶陰性的表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)為人體皮膚表面常見的共生菌，通常不致病。但近年來(lái)隨著各種植入性醫(yī)療材料的廣泛使用，表皮葡萄球菌已成為院內(nèi)感染的主要條件致病菌，主要原因是其能在這些醫(yī)療材料表面形成生物膜(biofilm，BF)樣結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)能夠更好地保護(hù)細(xì)菌抵抗抗生素的治療和人體免疫系統(tǒng)的攻擊，并從中不斷釋放細(xì)菌，從而造成機(jī)體的反復(fù)感染，最終不得不將被污染的植入性醫(yī)療材料通過(guò)外科手術(shù)摘除，對(duì)

2、患者造成極大的痛苦和對(duì)社會(huì)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。此外，由于抗生素的大量使用導(dǎo)致表皮葡萄球菌多重耐藥株(multi-drug resistant strains)的發(fā)生率日趨增高，急需開發(fā)新型的抗葡萄球菌感染的藥物，尤其是能有效殺傷生物膜包被細(xì)菌的抗生素。
　　 本課題的目的是發(fā)現(xiàn)抗表皮葡萄球菌的藥靶，為開發(fā)新型抗葡萄球菌感染的藥物奠定理論和實(shí)踐基礎(chǔ)，主要采用兩種策略：一種策略是通過(guò)生物信息學(xué)的方法尋找細(xì)菌必須蛋白質(zhì)，通過(guò)同源模建和

3、虛擬篩選技術(shù)獲得針對(duì)該蛋白的潛在的小分子抑制劑，結(jié)合分子生物學(xué)和微生物學(xué)的方法對(duì)小分子化合物的抑酶和抗菌活性進(jìn)行驗(yàn)證；另一種策略是通過(guò)傳統(tǒng)的微生物遺傳學(xué)和分子生物學(xué)方法深入研究表皮葡萄球菌臨床菌株生物膜形成的相關(guān)分子機(jī)制，發(fā)現(xiàn)潛在藥物靶標(biāo)，以期設(shè)計(jì)出針對(duì)生物膜的新型藥物。
　　 本論文分兩部分：第一部分通過(guò)生物信息學(xué)方法分析了表皮葡萄球菌色氨酰-tRNA合成酶作為抗菌靶標(biāo)的可行性，通過(guò)蛋白結(jié)構(gòu)同源模建和高通量虛擬篩選技術(shù)獲得潛在

4、的小分子抑制劑并對(duì)其生物學(xué)活性進(jìn)行研究，在體外驗(yàn)證了其抗菌活性；第二部分探討了表皮葡萄球菌雙組分信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)ArlRS對(duì)生物膜形成的調(diào)控作用，對(duì)其分子機(jī)制進(jìn)行了較深入的研究，認(rèn)為ArlRS可以作為抗生物膜的藥靶而發(fā)展出抗生物膜藥物。
　　 第一部分表皮葡萄球菌色氨酰tRNA合成酶作為抗菌靶標(biāo)的研究
　　 氨酰tRNA合成酶(ARS)是一類古老而保守、廣泛存在于動(dòng)物、植物、細(xì)菌、病毒等各種生物體中的酶。其功能是催化特定氨基

5、酸與相應(yīng)tRNA之間的連接反應(yīng)，以及水解錯(cuò)誤的連接并加以校正，從而保證核酸、蛋白質(zhì)之間信息傳遞的準(zhǔn)確性。由于氨酰tRNA合成酶是生物體中不能或缺的組成成分，而在真核生物和原核生物中又存在很大差異，使得在細(xì)菌多重抗藥性普遍越來(lái)越強(qiáng)、開發(fā)新藥的需求越來(lái)越迫切的今天，人們把目光投向了這類極具潛力的藥靶上來(lái)。色氨酰-tRNA合成酶(WRS)屬于氨酰tRNA合成酶Ⅰ類家族。目前針對(duì)WRS的有效抑制劑僅有吲哚霉素及其衍生物，但都未能進(jìn)入臨床實(shí)驗(yàn)。我

6、們運(yùn)用生物信息學(xué)方法確認(rèn)在表皮葡萄球菌全基因組中僅存在一個(gè)WRS的編碼基因trpS。通過(guò)對(duì)表皮葡萄球菌色氨酰-tRNA合成酶(SeWRS)的空間結(jié)構(gòu)進(jìn)行同源模建，并在此基礎(chǔ)上運(yùn)用高通量虛擬篩選技術(shù)共發(fā)現(xiàn)111個(gè)潛在的小分子抑制劑(先導(dǎo)化合物)，其中有三個(gè)化合物(Compound1-3)能明顯抑制靶蛋白的酶活性(半數(shù)抑制率濃度IC50范圍在15.1～42.2μM)，證實(shí)這3個(gè)化合物為SeWRS的抑制劑；而對(duì)人色氨酰-tRNA合成酶(HWR

7、S)活性的影響很弱(IC50范圍在89.3～>100μM)。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)這3個(gè)化合物能在體外與靶蛋白SeWRS相結(jié)合(結(jié)合平衡常數(shù)Kd范圍在3.76～13.9μM)。體外抑菌實(shí)驗(yàn)表明其中3個(gè)SeWRS抑制劑能明顯抑制表皮葡萄球菌的生長(zhǎng)(MIC范圍在6.25～100μM)，其中Compound1和Compound2能明顯抑制金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)；而上述3個(gè)SeWRS抑制劑在實(shí)驗(yàn)中的最高濃度(200μM)下對(duì)大腸桿菌的生長(zhǎng)均無(wú)抑制作用。

8、此外，這3個(gè)SeWRS抑制劑對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞(Vero細(xì)胞)無(wú)明顯細(xì)胞毒性，提示了這些化合物作為新型抗葡萄球菌感染藥物的開發(fā)前景。
　　 第二部分表皮葡萄球菌雙組分信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)ArlRS在生物膜形成中的作用：作為抗生物膜藥靶的可行性研究
　　 表皮葡萄球菌能夠形成生物膜(Biofilm)，該結(jié)構(gòu)是其抵抗抗生素治療和宿主免疫系統(tǒng)的攻擊、以及導(dǎo)致感染遷延不愈的主要原因，因此研發(fā)抗生物膜的藥物也是對(duì)抗表皮葡萄球菌感染的策略之一。

9、
　　 表皮葡萄球菌生物膜的形成及其調(diào)控是非常復(fù)雜的過(guò)程。表皮葡萄球菌生物膜的形成主要分為兩個(gè)階段：?jiǎn)蝹€(gè)細(xì)菌初始黏附到材料表面；細(xì)菌之間互相黏附，形成多細(xì)胞層的結(jié)構(gòu)。目前已發(fā)現(xiàn)了參與這兩個(gè)階段的一些功能基因(如atlE、icaADBC、aap、bap等)，其中icaADBC編碼細(xì)胞間多糖黏附素(Polysaccharide Intercellular Adhesion，PIA)，而PIA是表皮葡萄球菌生物膜的主要成分之一，但在表

10、皮葡萄球菌臨床分離株中也發(fā)現(xiàn)部分菌株的基因組中雖然存在icaADBC基因，但不形成生物膜(即ica+/BF-菌株)。很多調(diào)控因子(如sarA、sigB、agr等)在生物膜形成的兩個(gè)階段對(duì)上述功能性基因的表達(dá)起調(diào)控作用。目前，國(guó)外文獻(xiàn)和本實(shí)驗(yàn)室的相關(guān)研究均提示雙組分信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)(Two-component Signal Transduction Systems，TCSs)參與了生物膜形成的調(diào)控。本實(shí)驗(yàn)室前期研究在表皮葡萄球菌基因組中發(fā)現(xiàn)了

11、16對(duì)TCSs，本論文主要探討了其中的ArlRS對(duì)生物膜形成的調(diào)控機(jī)制，以期從中發(fā)現(xiàn)新的抗生物膜的靶點(diǎn)。
　　 首先使用溫度敏感性穿梭質(zhì)粒pBT2，采用同源重組法在表皮葡萄球菌1457株基因組中刪除了雙組分信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)ArlRS的組氨酸激酶編碼基因arlS，獲得了arlS基因刪除株(WW06株)；通過(guò)PCR、RT-PCR確認(rèn)arlS基因刪除株構(gòu)建成功，并采用梅里埃公司API-Staph細(xì)菌鑒定系統(tǒng)確認(rèn)WW06為表皮葡萄球菌。We

12、stern Blot結(jié)果表明WW06株不表達(dá)ArlR蛋白，因此WW06株是ArlRS系統(tǒng)缺失株。WW06株的生長(zhǎng)曲線與野生株相似，但不形成生物膜。對(duì)WW06株喪失生物膜形成能力的機(jī)制進(jìn)行了深入研究，發(fā)現(xiàn)其初始黏附能力并未發(fā)生變化，而通過(guò)基因芯片以及Real-Time RT-PCR等方法，發(fā)現(xiàn)參與生物膜形成第二階段的一些基因在突變株中的轉(zhuǎn)錄水平明顯降低，如icaADBC轉(zhuǎn)錄水平降低5-10倍、sigB轉(zhuǎn)錄水平降低約10倍、sarA轉(zhuǎn)錄水平

13、降低約3-5倍。凝膠遷移阻滯實(shí)驗(yàn)(EMSA)證明ArlR可以與icaADBC的啟動(dòng)子區(qū)特異性結(jié)合，提示ArlRS對(duì)icaADBC的轉(zhuǎn)錄起到直接調(diào)控作用。在WW06株中過(guò)表達(dá)icaADBC可以恢復(fù)形成生物膜的表型，而過(guò)表達(dá)sigB則不能恢復(fù)，上述結(jié)果證明icaADBC是ArlRS調(diào)節(jié)的下游功能基因，ArlRS通過(guò)直接調(diào)節(jié)icaADBC的轉(zhuǎn)錄對(duì)生物膜的形成起正調(diào)控作用。進(jìn)一步檢測(cè)9株ica+/BF-的表皮葡萄球菌在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中期(4hrs)的

14、icaADBC轉(zhuǎn)錄水平和arlRS的轉(zhuǎn)錄水平，結(jié)果顯示與SE1457相比，icaADBC和arlRS的轉(zhuǎn)錄水平均顯著降低，提示兩者之間存在相關(guān)性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明ArlRS可作為潛在的抗生物膜靶標(biāo)。
　　 本論文采用兩種策略，一方面通過(guò)生物信息學(xué)、結(jié)構(gòu)生物學(xué)和細(xì)菌分子生物學(xué)等方法獲得了具有抑菌活性的表皮葡萄球菌色氨酰tRNA合成酶抑制劑；另一方面通過(guò)細(xì)菌遺傳學(xué)和分子生物學(xué)等方法深入研究了表皮葡萄球菌雙組分信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)ArlRS對(duì)生物