甘氨酰tRNA合成酶調(diào)節(jié)奶牛乳腺上皮細胞NFκB1信號通路研究.pdf

1、本實驗室前期試驗表明，奶牛乳腺上皮細胞中，甘氨酰tRNA合成酶(GlyRS)能接受氨基酸信號，在544位蘇氨酸(T544)和704位絲氨酸（S704）處磷酸化，進入細胞核，調(diào)節(jié)乳蛋白合成，而其調(diào)節(jié)機制尚未發(fā)現(xiàn)。本試驗旨在揭示GlyRS調(diào)控乳蛋白合成的詳細分子機理。
　　通過添加0.6mmol/L的蛋氨酸（Met），建立Met促進β-酪蛋白(C SN2)合成表達的泌乳模型。檢測此泌乳模型中，NFκB1和p-NFκ1的表達與亞細胞定位

2、。檢測發(fā)現(xiàn)NFκB1在胞漿有分子質(zhì)量141kDa和105kDa兩種形式，而在胞核只有105kDa形式;NFκB1進入細胞核后存在分子剪切，剩下N端部分為p-NFκ1，分子質(zhì)量約為50kDa。細胞在Met促進作用下，NFκB1表達水平有所上升，而且p-NFκ1在胞核內(nèi)定位顯著升高。結(jié)果提示Met通過促進胞漿中NFκB1同IκBα解離進入細胞核，并發(fā)生磷酸化，從而調(diào)控乳合成相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄表達。
　　研究不同氨基酸處理對p-GlyRS的

3、表達影響，結(jié)果表明添加蛋氨酸、亮氨酸和賴氨酸均能使細胞中p-GlyRS、GlyRS和CSN2的表達顯著上升;在亞細胞定位中發(fā)現(xiàn)，GlyRS只存在于胞漿中，而p-GlyRS(T544)和p-GlyRS(S704)在胞漿中均為80kDa形式，在胞核中均為70kDa形式。添加氨基酸之后p-GlyRS在胞核中70kDa形式的定位明顯增加。數(shù)據(jù)表明，氨基酸刺激GlyRS磷酸化，并快速移入核中，被剪切成截短的形式。
　　本研究采用免疫共沉淀(

4、Co-IP)技術(shù)鑒定了細胞中NFκB1與GlyRS不結(jié)合，而與p-GlyRS(T544)和p-GlyRS(S704)在胞核中結(jié)合。
　　為研究p-GlyRS是否通過GCN2/eIF2α途徑影響NFκB1基因表達，對GlyRS進行過表達與干擾實驗，Western blotting檢測細胞中NFκB1、eIF2α、GCN2的表達情況和磷酸化水平。結(jié)果表明，氨基酸刺激GlyRS磷酸化入核，抑制GCN2磷酸化，并調(diào)節(jié)NFκ1的轉(zhuǎn)錄激活，從

5、而促進乳蛋白的合成。
　　本研究采用放線菌酮抑制總蛋白合成，觀察在Met信號刺激下，GlyRS、NFκ B1、mTOR和Stat5的表達情況和磷酸化水平。結(jié)果顯示，放線菌酮使各蛋白的表達水平降低，添加Met使各蛋白表達水平有所增加。提示GlyRS感應(yīng)氨基酸信號并不依賴于蛋白質(zhì)翻譯過程。本研究繼續(xù)驗證GlyRS磷酸化是否依賴于mTOR途徑。用雷帕霉素抑制mTOR活性，Westernblotting檢測細胞中NFκB1、GlyRS、m

6、TOR及其磷酸化的表達情況。結(jié)果顯示，在雷帕霉素抑制作用下額外添加Met，細胞中GlyRS、p-GlyRS、NFκ B1和p-NFκB1表達水平均顯著升高。表明雷帕霉素沒有抑制Met信號下GlyRS和NFκB1的磷酸化，說明GlyRS的磷酸化作用不依賴于mTOR途徑，即mTOR不是GlyRS的上游激酶。
　　綜上所述，氨基酸的促進作用，使GlyRS在T544和S704處磷酸化，進入細胞核，被剪切成了截短的形式，抑制GCN2磷酸化，