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1、氨酰-tRNA合成酶是蛋白質(zhì)合成過程中的一類關(guān)鍵酶,具有氨?;慕?jīng)典功能。近年來研究發(fā)現(xiàn),氨基酰tRNA合成酶家族的許多成員能夠在基因表達(dá)的調(diào)控、促進(jìn)血管生成、炎癥反應(yīng)的發(fā)生等生命活動(dòng)中起重要作用。這些研究結(jié)果提示我們,深入探究氨基酰tRNA合成酶除氨?;酝獾男鹿δ苁巧飳W(xué)領(lǐng)域不可忽視的方向。實(shí)驗(yàn)室前期研究表明甘氨酰tRNA合成酶(glycyl-tRNA synthetase,GlyRS)作為氨酰tRNA合成酶家族的一員,除了在蛋白翻
2、譯過程中發(fā)揮氨?;饔猛猓赡軈⑴c催乳素、王不留行、雌激素和營養(yǎng)素(氨基酸)等調(diào)控奶牛乳腺上皮細(xì)胞乳蛋白的合成,但具體機(jī)制還不清楚。前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果還提示GlyRS能夠接受氨基酸信號(hào),并發(fā)生磷酸化,進(jìn)入細(xì)胞核。前期實(shí)驗(yàn)也揭示了GlyRS在細(xì)胞漿中的相互作用蛋白質(zhì)組,為闡明氨基酸對(duì)GlyRS的調(diào)節(jié)機(jī)理提供了重要信息。本實(shí)驗(yàn)擬依據(jù)對(duì)GlyRS細(xì)胞漿相互作用蛋白質(zhì)組的生物信息學(xué)分析,揭示氨基酸通過GPR87及其下游的CDC42/Rac1/RhoA
3、信號(hào)通路激活MAP3K10從而激活GlyRS的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。本研究工作將為深入揭示GlyRS介導(dǎo)氨基酸調(diào)節(jié)乳蛋白合成的信號(hào)途徑提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用免疫共沉淀(Co-IP)技術(shù)鑒定了MAP3K10與GlyRS存在相互作用。添加氨基酸并同時(shí)利用siRNA抑制MAP3K10,Western blotting檢測(cè)發(fā)現(xiàn),抑制MAP3K10顯著降低了氨基酸對(duì)GlyRS磷酸化的刺激作用。利用siRNA對(duì)CDC42或Rac1進(jìn)行了干擾。
4、結(jié)果發(fā)現(xiàn)在干擾了CDC42或Rac1表達(dá)后,MAP3K10的表達(dá)量無明顯變化,但磷酸化MAP3K10(p-MAP3K10)的表達(dá)顯著降低。而在同時(shí)干擾了這兩個(gè)基因后,p-MAP3K10減少的量更為顯著。提示CDC42/Rac1作為MAP3K10的上游,調(diào)節(jié)MAP3K10磷酸化,CDC42和Rac1的功能冗余。發(fā)現(xiàn)添加蛋氨酸、亮氨酸、賴氨酸后,GPR87的表達(dá)量增加,而在利用siRNA抑制GPR87的表達(dá)后,氨基酸對(duì)GlyRS磷酸化的刺激
5、作用受到了顯著抑制。構(gòu)建GPR87的真核表達(dá)載體,進(jìn)行GPR87過表達(dá),發(fā)現(xiàn)CDC42/Rac1的GTP結(jié)合形式的量明顯增多,且p-MAP3K10的表達(dá)量也明顯增加。而在GPR87過表達(dá)時(shí)同時(shí)利用siRNA抑制CDC42或Rac1,p-MAP3K10的表達(dá)量顯著降低。進(jìn)行MAP3K10過表達(dá)并同時(shí)利用siRNA抑制GlyRS,發(fā)現(xiàn)GlyRS介導(dǎo)MAP3K10對(duì)NFκB1的磷酸化激活作用。
以上研究表明,奶牛乳腺上皮細(xì)胞接收到外
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