牛胚胎體外生產(chǎn)影響因素及LAMP法快速鑒定胚胎性別的研究.pdf

1、本試驗從屠宰場廢棄的牛卵巢表面抽取直徑在2～6mm的卵泡的卵泡液,并從卵泡液中分揀出外被多層卵丘細胞的卵丘卵母細胞復合體(COCs),然后對COCs進行成熟培養(yǎng)、體外受精和受精后胚胎的體外培養(yǎng)直至囊胚。隨后,以LAMP(環(huán)介導恒溫擴增)方法為依托對生產(chǎn)胚胎進行性別鑒定,該方法省時、簡便,準確率高,具體內容包括以下幾部分： 1.EGF對牛卵母細胞體外成熟的影響、肝素對卵裂率和胚胎發(fā)育的影響、不同的培養(yǎng)體系對胚胎體外發(fā)育的影響

2、 (1)在成熟培養(yǎng)液中加入不同濃度的EGF后均能提高卵母細胞的成熟率,隨著EGF濃度的增加,卵母細胞的成熟率也隨之提高。添加30ng/mLEGF組的卵母細胞的成熟率為64.41％,與對照組之間差異不顯著(P>0.05);添加50ng/mL與70ng/mLEGF組間的成熟率差異不顯著(P>0.05),但均顯著高于對照組與30 ng/mLEGF組(P<0.05)。 (2)不同濃度肝素處理受精液后,對卵裂率有顯著影響,特別是當肝素濃

3、度為5μg/mL時,卵裂率僅為53.93％,顯著低于其他組(P<0.05).其他三組卵裂率隨肝素濃度增加依次升高,分別為67.22％,73.08％,76.50％,差異不顯著；肝素濃度為80μg/mL時,囊胚率為22.22％,與其他三組差異顯著(P<0.05),其他組囊胚率分別為33.33％,32.23％,35.96％。 (3)分別用mSOF+顆粒細胞共培養(yǎng)體系和M199+顆粒細胞共培養(yǎng)體系培養(yǎng)卵母細胞,兩種培養(yǎng)體系在卵裂率方面差

4、異不顯著(P>0.05),M199+顆粒細胞組囊胚率(25.00％)與mSOF+顆粒細胞共培養(yǎng)組囊胚率(36.09％)間差異顯著(P<0.05),說明本試驗條件下mSOF+顆粒細胞共培養(yǎng)的培養(yǎng)體系更適合牛胚胎的體外發(fā)育。 2.以LAMP方法為基礎,對生產(chǎn)的體外胚胎進行性別鑒定 本試驗優(yōu)化了環(huán)介導恒溫擴增方法,以?；蚪M為模板,設計了牛雄性特異性和牛特異性LAMP引物,并且優(yōu)化了其反應條件,使LAMP在最佳的條件下進行擴增