PCR及LAMP法牛胚胎性別鑒定的應(yīng)用研究.pdf

1、胚胎性別鑒定是胚胎工程技術(shù)的重要部分之一,對(duì)家畜育種、生產(chǎn)和遺傳疾病的防治均有非常重要的意義.該論文為建立一種快速、可靠、易操作的牛胚胎性別鑒定方法做了以下探討:1、選用牛Y染色體特異序列設(shè)計(jì)引物建立PCR牛胚胎性別鑒定擴(kuò)增體系.分別選擇BOV97M做公牛特異擴(kuò)增引物及1.715衛(wèi)星DNA做牛特異擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)引物.在連續(xù)多重PCR里,前11個(gè)循環(huán)只用雄性特異引物擴(kuò)增,之后再加入內(nèi)標(biāo)引物繼續(xù)進(jìn)行25個(gè)循環(huán)的擴(kuò)增.BOV97M引物擴(kuò)增產(chǎn)物為14

2、1bp,牛衛(wèi)星1.715DNA擴(kuò)增產(chǎn)物為216bp.用牛血樣DNA優(yōu)化連續(xù)多重PCR體系,該體系的準(zhǔn)確率和靈敏度分別為100％(66/66)、10pg?；蚪MDNA(約3個(gè)細(xì)胞).由于在擴(kuò)增過程中暫停循環(huán)添加內(nèi)標(biāo)引物,不僅費(fèi)時(shí)費(fèi)力,而且容易污染,故該擴(kuò)增體系不適宜做為現(xiàn)場(chǎng)牛胚胎性別鑒定試劑盒.2、選用牛牙釉蛋白(bAML)序列設(shè)計(jì)一對(duì)引物建立PCR牛胚胎性別鑒定擴(kuò)增體系.該P(yáng)CR體系對(duì)母牛DNA擴(kuò)增只有一種產(chǎn)物(467bp),而對(duì)公牛D

3、NA的擴(kuò)增有兩種大小不同的產(chǎn)物(467bp,341bp).該實(shí)驗(yàn)從鎂離子濃度、退火溫度、酶濃度、引物濃度、變性劑、循環(huán)數(shù)及反應(yīng)體積等方面對(duì)上述PCR系統(tǒng)進(jìn)行了優(yōu)化.優(yōu)化體系為:50mM KCl;10mM Tris-HCl;0.1％TritonX-100;2.0mM MgCl<,2>;0.25mM/dNTP;3U Taq DNA聚合酶;每條引物20pM.共50循環(huán),前20個(gè)退火溫度為53℃,后30個(gè)為54℃,反應(yīng)體積50ul.其準(zhǔn)確率和靈

4、敏度分別為100％(60/60)和10pg DNA.該擴(kuò)增體系優(yōu)點(diǎn)在于選用一對(duì)引物,準(zhǔn)確、靈敏、快速,適宜做牛胚胎性別鑒定試劑盒.3、對(duì)日本產(chǎn)品LAMP(Loop-mediated isothermal amplification)法牛胚胎性別鑒定試劑盒進(jìn)行了評(píng)價(jià)研究.運(yùn)用該試劑盒在實(shí)驗(yàn)室及現(xiàn)場(chǎng)鑒定胚胎性別,準(zhǔn)確率為100％(30/30),靈敏度為1pg,現(xiàn)場(chǎng)移植符合率為3/3,具有快速、準(zhǔn)確、靈敏、易檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn).不足之處是在高濃度模板