豬胞內(nèi)勞森氏菌LAMP、PCR快速檢測(cè)方法的建立及應(yīng)用.pdf

1、豬增生性腸炎(Porcine proliferative enteropathy, PPE)是由于豬感染胞內(nèi)勞森氏菌引起的一種傳染性腸道出血性的消耗性疾病，1931年Bieste和Sohwarce首次報(bào)道了該病，1974年Rowland等證實(shí)了該病，該病現(xiàn)已成為世界上流行最廣的豬病之一。雖然，豬增生性腸炎引起的死亡率不高，但由于其主要發(fā)病為慢性型，使得患病豬生長(zhǎng)緩慢，飼料利用率和平均日增重明顯下降，淘汰率上升，導(dǎo)致豬場(chǎng)經(jīng)濟(jì)損失嚴(yán)重。一些

2、養(yǎng)豬業(yè)發(fā)達(dá)的國家和地區(qū)，由于飼料中抗生素的禁用或限用，導(dǎo)致豬增生性腸炎發(fā)病率逐年上升。在我國，臨床豬增生性腸炎疑似病例有逐漸增多的趨勢(shì)，但我國對(duì)豬增生性腸炎的研究還處于起步階段，缺乏對(duì)該病的流行病學(xué)調(diào)查，因此開發(fā)快速準(zhǔn)確的臨床檢測(cè)方法對(duì)于該病的研究具有重要的意義。
　　本試驗(yàn)根據(jù)引物設(shè)計(jì)原理，針對(duì)胞內(nèi)勞森氏菌AM18025.2.1基因序列分別設(shè)計(jì)了PCR和環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(loop-mediated isothermal amp

3、lification，LAMP)特異性引物，通過對(duì)PCR方法退火溫度的優(yōu)化，LAMP方法的反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間、內(nèi)外引物比例、dNTP濃度、鎂離子濃度、甜菜堿的優(yōu)化，確定其最優(yōu)反應(yīng)條件后成功建立了胞內(nèi)勞森氏菌的PCR和LAMP兩種檢測(cè)方法。靈敏度實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明建立的PCR方法可檢出的拷貝數(shù)為103個(gè)，LAMP方法可檢出的拷貝數(shù)為101個(gè);特異性試驗(yàn)表明，PCR方法和LAMP方法對(duì)E.coli、Salmonella、PEDV、PRV擴(kuò)增結(jié)果均

4、為陰性，且這兩種方法穩(wěn)定性和重復(fù)性良好。LAMP反應(yīng)產(chǎn)物還可進(jìn)行可視化檢測(cè)，陽性反應(yīng)產(chǎn)物在自然光下出現(xiàn)明顯渾濁，加入SYBR GreenⅠ染料后，在紫外燈照下，陽性反應(yīng)管發(fā)出綠色熒光，而陰性反應(yīng)管無熒光現(xiàn)象出現(xiàn)。
　　應(yīng)用本試驗(yàn)建立的PCR和LAMP兩種方法檢測(cè)從四川部分規(guī)?；B(yǎng)豬場(chǎng)采集的114份糞便樣本，其中60份樣本(52.6％)利用PCR和LAMP檢測(cè)方法均檢出為陽性，13份樣本(11.4％)利用LAMP檢測(cè)方法檢出為陽性，

5、PCR檢測(cè)方法檢出為陰性，41份樣本(36.0％)利用PCR和LAMP檢測(cè)方法均檢出為陰性。應(yīng)用FIRSTtest試劑盒進(jìn)行復(fù)核檢測(cè)，PCR檢測(cè)方法的符合率為76.0％，LAMP檢測(cè)方法的符合率為92.4％，LAMP檢測(cè)方法具有更高的靈敏度。
　　胞內(nèi)勞森氏菌引起的豬增生性腸炎造成的死亡率不高，但是對(duì)豬場(chǎng)的經(jīng)濟(jì)造成較大的損失，且該病目前在我國感染率較高。本試驗(yàn)所建立的PCR和LAMP兩種方法具有快速簡(jiǎn)便的特點(diǎn)，且LAMP方法不需要