豬胚胎體外生產(chǎn)與卵母細(xì)胞冷凍保存技術(shù)研究.pdf

1、建立豬卵母細(xì)胞體外成熟、體外受精和胚胎體外培養(yǎng)技術(shù)配套，進一步改善其操作程序、提高其效率，是實現(xiàn)豬胚胎體外生產(chǎn)的關(guān)鍵。目前，豬卵母細(xì)胞冷凍保存尚未取得突破性進展，冷凍方案尚待優(yōu)化。系統(tǒng)研究豬胚胎體外生產(chǎn)與卵母細(xì)胞冷凍保存技術(shù)，有助于完善胚胎體外生產(chǎn)的技術(shù)配套，尋求豬種質(zhì)資源保存的新途徑和有效方法；有助于豬胚胎生物技術(shù)研究的實用化，豐富發(fā)育生物學(xué)文庫。因此，具有重要的理論意義和實用價值。本研究以屠宰豬卵巢為材料，旨在通過對豬胚胎體外生產(chǎn)過

2、程中關(guān)鍵技術(shù)的研究，建立簡便、有效的技術(shù)體系，為建立豬胚胎體外生產(chǎn)技術(shù)平臺奠定基礎(chǔ)。 1．豬胚胎體外生產(chǎn)的關(guān)鍵技術(shù)研究 本試驗以屠宰豬卵巢為研究對象，系統(tǒng)比較了采卵方法、卵巢運輸溫度、血清、激素、豬卵泡液、卵泡大小和卵巢類型等對卵母細(xì)胞體外成熟和體外受精的影響。結(jié)果表明，切割法所獲卵母細(xì)胞數(shù)及每只卵巢平均采卵數(shù)均顯著高于抽吸法，但卵母細(xì)胞體外成熟率(43.3％)明顯低于抽吸法(75.6％，P<0.05)；抽吸法可獲得較高

3、的卵母細(xì)胞可用率。屠宰豬卵巢運輸溫度為37℃和25℃時，可分別獲得76.7％和80.2％的卵母細(xì)胞體外成熟率，52.2％和52.4％的卵裂率及17.7％和18.1％的桑椹胚發(fā)育率；當(dāng)運輸溫度降為15℃時，成熟率、卵裂率和桑椹胚發(fā)育率均表現(xiàn)下降；若降到10℃時，成熟率、卵裂率和桑椹胚發(fā)育率僅為44.2％、22.7％和4.55％，顯著低于37℃和25℃組(P<0.05)。采用抽吸法采集中型卵泡(直徑2～5 mm)卵母細(xì)胞進行體外培養(yǎng)，結(jié)果發(fā)

4、現(xiàn)，成熟培養(yǎng)液中無血清添加組，卵母細(xì)胞的卵丘擴散率和pbI排出率分別為47.4％和47.8％，均顯著低于添加血清的兩組(P<0.05)。激素和豬卵泡液(pFF)的添加，對體外成熟和體外受精具有積極作用，在添加激素和pFF的成熟培養(yǎng)液中培養(yǎng)24 h后，轉(zhuǎn)入無激素、無pFF培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)20 h，卵丘擴散率可達(dá)85.3％，桑椹胚發(fā)育率為17.7％；連續(xù)培養(yǎng)對照組的桑椹胚發(fā)育率最高，為28.7％。對不同大小卵泡的卵母細(xì)胞研究表明，小卵泡卵母

5、細(xì)胞發(fā)育能力顯著低于大、中卵泡卵母細(xì)胞(P<0.05)。卵母細(xì)胞無論來自黃體卵巢組，還是無黃體卵巢組，其體外發(fā)育能力無明顯差別(P>0.05)。在精子獲能液mTBM液中，單獨添加肝素的體外受精效果顯著優(yōu)于咖啡因組和混合添加肝素與咖啡因組。本實驗表明，NCSU-23用于培養(yǎng)豬體外受精胚胎，可獲得29.1％的桑椹胚發(fā)育，效果最佳。 2．豬卵母細(xì)胞的玻璃化冷凍技術(shù)研究本試驗將3種冷凍液組合(EFS40、EDS和ES)和3種不同冷凍載體(OP

6、S法、細(xì)管法和電鏡銅網(wǎng)法)，用于豬未成熟(GV期)和體外成熟(MII期)卵母細(xì)胞的冷凍保存，比較其冷凍效果；同時，對細(xì)胞松弛素B和離心極化處理在卵母細(xì)胞冷凍中的作用進行研究。用抽吸法從屠宰豬卵巢表面直徑2～5 mm卵泡中，采集GV期卵母細(xì)胞；由GV期卵母細(xì)胞經(jīng)成熟培養(yǎng)獲得MII期卵母細(xì)胞。3組冷凍液組合(EFS40、EDS和ES)毒性試驗表明，ES液組合無論對GV期、還是MII期卵母細(xì)胞，毒性作用最小。以ES液組合作玻璃化冷凍液，3種冷

7、凍載體分別用于豬GV期和MII卵母細(xì)胞的冷凍后發(fā)現(xiàn)，OPS法冷凍豬GV期卵母細(xì)胞，所獲凍后存活率明顯高于電鏡銅網(wǎng)法和細(xì)管法(65.4％對45.O％和38.6％,P＜0.05)，并可獲得最佳的凍后成熟率(43.3％)；從MII期卵母細(xì)胞凍后存活率等指標(biāo)看，OPS法也明顯優(yōu)于細(xì)管法和電鏡銅網(wǎng)法。采用ES液組合和OPS法，玻璃化冷凍保存豬GV期和MII卵母細(xì)胞，兩組卵母細(xì)胞的凍后形態(tài)正常率無顯著差別(分別為92.4％和94.2％，p＞0.05

8、)，但GV期卵母細(xì)胞凍后臺盼藍(lán)染色和FDA染色存活率，均明顯高于MlI期卵母細(xì)胞(分別為60.O％和56.8％對49.2％和41.9％，P＜0.05)。GV期卵母細(xì)胞冷凍后，獲得7.8％的卵裂率，12枚卵裂胚經(jīng)體外培養(yǎng)后，6枚發(fā)育至8-細(xì)胞，3枚發(fā)育至16-細(xì)胞，3枚發(fā)育至桑椹胚；而MII期卵母細(xì)胞冷凍后未獲得卵裂，豬GV期卵母細(xì)胞似乎比MII期卵母細(xì)胞更適合冷凍保存。冷凍豬GV期卵母細(xì)胞，經(jīng)體外受精后獲得卵裂和桑椹胚發(fā)育，是迄今為止相