豬體外生產(chǎn)胚胎玻璃化冷凍保存的研究.pdf

1、哺乳動(dòng)物胚胎的冷凍保存在動(dòng)物種質(zhì)資源保存方面日益顯示出強(qiáng)大的應(yīng)用潛力。豬的胚胎冷凍保存對(duì)于良種資源的保存和世界范圍內(nèi)豬的品種改良非常重要,備受關(guān)注。自從1998年Vajta用OPS管成功冷凍豬桑椹胚和囊胚以來,玻璃化冷凍顯示出了極大優(yōu)勢(shì)。本實(shí)驗(yàn)在研究了豬體外受精、胚胎培養(yǎng)條件后運(yùn)用OPS管冷凍了豬的體外受精胚胎,比較了不同時(shí)期、不同冷凍保護(hù)劑和不同預(yù)處理方法冷凍早期體外受精胚胎的效果,旨在建立一套有效的豬體外受精胚的玻璃化冷凍保存技術(shù).

2、本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果如下： 1.以豬新鮮精液、冷凍豬新鮮精液進(jìn)行豬的體外受精,以活力較低(<0.5)且畸形率較高(>30％)的新鮮精液進(jìn)行體外受精后受精胚的卵裂率較活力(>0.8)和形態(tài)(畸形率<10％)都正常的鮮精組差異不顯著(51％vs53.6％),但是受精后桑椹胚的發(fā)育率明顯低于正常鮮精組(28.9％vs47.4％);以活力較高(>0.5)的凍精進(jìn)行體外受精后受精胚的卵裂率和桑椹胚的發(fā)育率與正常的鮮精組無明顯差異(54.3％vs5

3、1.1％,48.2％vs45.4％);以活力(≤0.4)較低的凍精進(jìn)行體外受精其受精胚的卵裂率較活力(>0.5)高的凍精組無明顯差異(56.4％vs54.3％),但是受精后桑椹胚的發(fā)育率明顯低于活力高的凍精組(37.0％vs48.2％)。另外,用不同精-卵比例(分別為Group A:12000:1、GroupB:6000:1、Group C:3000:1)凍精進(jìn)行體外受精,發(fā)現(xiàn)A組受精胚的卵裂率(37.5％)和桑椹胚的發(fā)育率(34.4％

4、)都明顯低于B、C組,后兩組受精胚的卵裂率和桑椹胚的發(fā)育率無明顯差異(54.3％vs 54.2％,48.5％vs 45.7％)。結(jié)果表明精液質(zhì)量會(huì)影響體外受精胚的后續(xù)發(fā)育；無論是鮮精或是凍精,精子活力并不是影響體外受精卵裂率的決定因素；體外受精時(shí)合適的精卵比例提高了受精胚后續(xù)的發(fā)育能力。 2.采用NCSU-23和PZM-3中培養(yǎng)后的卵裂率分別是54.7％、55.0％,差異不顯著；前者獲得了46.2％的桑椹胚發(fā)育率,比后者40.3

5、％的桑椹胚發(fā)育率高,但兩者差異不顯著。單獨(dú)采用NCSU-23培養(yǎng)豬體外受精胚卵裂率和桑椹胚的發(fā)育率分別是61.1％和47.2％,與輸卵管上皮細(xì)胞單層共培養(yǎng)后卵裂率和桑椹胚的發(fā)育率分別是63.4％和49.3％。共培養(yǎng)后的卵裂率和桑椹胚的發(fā)育率都稍高于單獨(dú)用NCSU-23培養(yǎng),但兩者差異不顯著。 3.采用EDS(15％乙二醇、15％二甲基亞砜、0.5M蔗糖)直接冷凍合子期受精胚獲得了62.3％的存活率,顯著高于2-8細(xì)胞、8-16細(xì)

6、胞、桑椹胚組,后三組冷凍解凍后的胚胎存活率都很低,分別是8.7％、4.4％和5.6％。 4.采用ES(40％乙二醇、0.5M蔗糖)直接冷凍冷凍合子期受精卵解凍后形態(tài)正常率和存活率分別只有53.3％和31％,明顯低于EDS組(90％和72.7％),說明EDS冷凍保護(hù)效果好于ES。用細(xì)胞松弛素B處理合子期體外受精卵冷凍解凍后的形態(tài)正常率是60.6％,明顯低于直接冷凍組(81.7％);CB處理合子期體外受精卵冷凍解蒜后受精卵的存活率為